臭氧與藥物治療對兔骨性關節炎血清中IL-1β、TNF-α含量的影響

符路娣

（廣州中醫藥大學實驗動物中心，廣東廣州 510405）

骨性關節炎（Osteoarthritis,OA）是我國四大老年病之一，是一種嚴重影響病人生活質量和社會生產力的慢性進行性骨關節病。該病不僅發生關節軟骨損傷，還累及整個關節，包括關節軟骨下骨、韌帶、關節囊、滑膜和關節周圍肌肉，最終發生關節軟骨退變，纖維化，斷裂潰瘍及整個關節面的損害[1]。近年來，隨著對OA 發病機制研究的深入，認識到在OA 的病理過程中白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α) 是促進軟骨基質降解和關節軟骨破壞的致炎因子。目前對OA 的治療方法頗多但效果不夠理想。本實驗應用家兔OA 模型進行研究，觀察比較臭氧和藥物治療的效果。現將實驗報告如下。

1 材料與方法

1.1 OA 模型制備及分組

新西蘭兔80只，體重2.2-2.5kg，雌雄各半，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（粵）2008-0020。隨機抽取10只作為正常對照組（簡稱A組），正常組不做任何處理，正常喂養。其余70只，分別于實驗的第1 天、第4天于右膝關節腔內注射Ⅱ型膠原蛋白酶溶液0.5ml 制備骨性關節炎動物模型，造模成功后隨機分為模型對照組(簡稱B組)和治療組，治療組又分為:10ug/ml 臭氧關節腔內注射治療組（簡稱C10組）,20ug/ml 臭氧關節腔內注射治療組（簡稱C20組）；40ug/ml 臭氧關節腔內注射治療組（簡稱C40組）；低劑量活血止痛膠囊灌胃治療組（簡稱D低組）,中劑量活血止痛膠囊灌胃治療組（簡稱D中組）；高劑量活血止痛膠囊灌胃治療組（簡稱D高組），每組10只。

1.2 方法

1.2.1 造模方法

（1）II 型膠原蛋白酶的配制：將II 型膠原蛋白酶按2mg/0.5ml 的濃度溶解于生理鹽水中，用0.2um 的無菌試管濾器過濾后裝入50ml 無菌瓶中，并置于0℃以下冰箱內保存備用。

（2）蛋白酶溶液的注射：將新西蘭兔固定于固定架上，剪去膝關節處的兔毛，75%酒精消毒后用左手從下方和兩旁將關節固定，在髕韌帶附著點外上方約0.5cm 處進針。針頭從上前方向下后方傾斜刺入，直至針頭遇阻力變小為止，然后針頭稍后退，以垂直方向推入，當出現落空感時，表明已進入關節腔內，即可注入藥液。

1.2.2 細胞因子檢測

A.經耳中動脈抽取5ml 血液，4000 轉離心10 min，分離血清約600μl，保存于-80℃冰箱備檢。

B.雙抗體ELISA 法測定IL-1β、TNF-α 的含量。根據血清樣品的吸光度值,通過擬合后的公式計算出其濃度。

1.3 實驗設備與藥物

A.實驗設備：意大利ECO3 di Franco Sardi 公司生產的Ozonline-E80 型醫用臭氧發生器；

B.藥物：活血止痛膠囊（中藥制劑，主要組成：當歸、三七、土鱉蟲等）。

1.4 統計學處理

數據以SPSS 軟件進行統計分析，并以均數上標準差表示結果。

2 結果

各實驗組血清TNF-α和IL-1β 活性的測量結果詳見下表。

由表可見，B、C、D組與A組比較有顯著性差異（p＜0.05）,這說明造模成功；C組與B組比較沒有顯著性差異（p＞0.05）,這說明臭氧無抑制已升高的血清TNF-α和IL-1β含量的作用；D組與B組比較有顯著性差異（p＜0.05），這說明藥物灌胃治療均能抑制已升高的血清TNF-α和IL-1β含量的作用。

表各組血清TNF-α和IL-1β 濃度

3 討論

3.1 IL-1β 在OA 病程中的作用

在骨性關節炎病理進程中,關節軟骨和滑膜的病理變化是由一系列細胞因子的變化引起的。其中備受關注的細胞因子是IL-1β和TNF-α，經研究證實，這兩種細胞因子是OA 病理變化過程中加速軟骨基質降解和促使關節軟骨退變的最重要的兩種細胞因子[2]，是炎癥反應的調節劑。1983年Wood等首先報道了在骨性關節炎和類風濕性關節炎患者的關節液中檢測到了高水平的IL-1，提出IL-1 可能直接參與了骨關節炎的病理增生過程。在隨后的研究中，有更多學者證實了Wood的觀點，并進一步證實細胞因子的活性與關節軟骨的破壞嚴重程度呈正相關。IL-1 為17KDb 的細胞因子，主要由單核-巨噬細胞產生，也能由中性粒細胞合成，分為膜結合型（IL-1α）和可溶型（IL-1β）兩種。IL-1 多存在于血液和組織中，它在OA 中主要參與刺激前列腺炎等介質釋放，上調內皮細胞粘附分子受體表達，以及促進膠原酶和其他中性蛋白酶合成，從而增強滑膜和滑液內炎癥反應，促進滑膜細胞增生正常狀態下保持平衡；失衡時，產生免疫病理反應[3-6]。有研究證明IL-1是炎癥調節的始動因素，與受體（IL-1RI）結合后形成復合物，繼而發生一系列的級聯反應，導致NO、PGE2、IL-6、IL-8以及基質金屬蛋白酶(MMPs)水平增高，從而介導軟骨細胞凋亡，合成II型膠原和蛋白多糖的能力損害，以及軟骨基質降解[7-8]。

3.2 TNF-α 在OA 病程中的作用

TNF-α 是體內炎癥細胞分泌的一種細胞因子，是復合體，具有多種生物學活性。在骨性關節炎滑液中TNF-α 是最早出現的細胞因子，而且影響關節軟骨的降解過程[9]。TNF-α 可通過直接與破骨細胞前體上的TNFR-1 結合，進而誘導破骨細胞的成熟，或者使間充質細胞上的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）表達增加，進一步誘導破骨細胞發育成熟或破骨細胞功能增強，導致骨質吸收和骨質破壞[10]。

本實驗中檢測到OA 模型中的血清IL-1β和TNF-α含量都升高,與其他研究結果一致,采用臭氧進行局部治療的血清IL-1β和TNF-α含量的變化無統計學意義,這也說明臭氧的局部應用并沒有對這兩種細胞因子的產生起到抑制或降低其含量的作用。臭氧對骨關節炎的作用機制,仍需進行更多的實驗研究進一步證實。

活血止痛膠囊治療的血清IL-1β和TNF-α含量的變化有統計學意義,這可能是活血止痛膠囊通過降低骨關節液中IL-1β和TNF-α 的含量,從而降低關節的局部炎癥反應、消腫鎮痛等作用。這些可能與藥物中當歸、三七、土鱉蟲等成分具有抗炎、止痛作用有關。

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