amiRNA-Snai1 逆轉人胃癌細胞株SGC7901/DDP對順鉑的耐藥性及其機制研究*

許春紅 郭慧敏 王 軍 李建琦 陳 敏 鄒曉平

南京醫科大學附屬鼓樓臨床醫學院消化科1（210008）南京大學醫學院附屬鼓樓醫院消化科2

多藥耐藥是惡性腫瘤化療失敗的主要原因。Snai1 為鋅指轉錄因子Snail 家族成員之一，研究顯示其可通過調控下游靶基因E-鈣黏蛋白（Ecadherin）等的表達介導腫瘤細胞發生上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition,EMT），促進腫瘤侵襲轉移[1～3]。此外，有研究發現包括Snai1 及其調控的信號通路在內的EMT 相關基因與腫瘤耐藥相關，腫瘤細胞發生EMT 可促成腫瘤對化療耐藥[4～6]。本研究以人工合成microRNA（artificial microRNA,amiRNA）-Snai1 質粒轉染對順鉑（cisplatin,DDP）耐藥的人胃癌細胞株SGC7901/DDP 以沉默Snai1 基因表達，通過觀察SGC7901/DDP 細胞中Snai1、Ecadherin和耐藥基因切除修復交叉互補基因1（ERCC1）蛋白表達的變化及其對DDP 敏感性的變化，探討amiRNA-Snai1 逆轉SGC7901/DDP 細胞對DDP 耐藥性的作用及其可能機制，為進一步明確Snai1 及其調控的信號通路在胃癌多藥耐藥中的作用提供實驗依據。

材料與方法

一、腫瘤細胞株和主要試劑

人中分化胃腺癌細胞株SGC7901、SGC7901/DDP和amiRNA-Snai1 真核表達質粒為南京醫科大學附屬鼓樓臨床醫學院消化科實驗室凍存或構建；DDP（齊魯制藥有限公司）；LipofectamineTM2000轉染試劑、殺稻瘟素、熒光二抗、DAPI（invitrogenTM,Life Technologies Corporation）；兔抗人Snai1+Snai2多克隆抗體、小鼠抗人ERCC1 單克隆抗體（Abcam plc.），兔抗人E-cadherin 單克隆抗體（Cell Signaling Technology,Inc.）；CCK-8 試劑盒（日本株式會社同仁化學研究所）。

二、實驗方法

1.細胞培養：SGC7901、SGC7901/DDP 細胞以含10%胎牛血清的RPMI1640 培養基培養于37 ℃、5% CO2培養箱中，常規消化傳代。SGC7901/DDP細胞培養基中含終濃度0.1 mg/L 的DDP。

2.穩定轉染細胞株的構建和鑒定：取對數生長期SGC7901/DDP 細胞，參照LipofectamineTM2000 轉染試劑說明書將amiRNA-Snai1 真核表達質粒和陰性對照質粒分別轉染入細胞中（SGC7901/DDP-amiRNA組和SGC7901/DDP-Mock組），轉染24 h 后以殺稻瘟素（5 μg/mL）篩選，采用有限稀釋法將存活細胞接種于96 孔板培養15 d，獲得穩定轉染單克隆，以含殺稻瘟素維持濃度2.5 μg/mL 的培養基繼續培養。蛋白質印跡法和免疫熒光法檢測穩定轉染細胞株的Snai1 蛋白表達，以明確amiRNA的沉默效應。

3.CCK-8 法檢測細胞存活率：此實驗步驟設SGC7901/DDP-amiRNA、SGC7901/DDP-Mock、SGC7901/DDP 三組。將細胞懸液（1×104/mL）接種于96 孔板，200 μL/孔。細胞貼壁后，棄原培養基，加入含終濃度0.01、0.1、1.0、10.0 mg/L DDP的培養基，另設不加藥物的對照組和不接種細胞、僅加入培養基的調零孔，每組設3個復孔。細胞培養24 h后，棄含藥培養基，加入新鮮配制的CCK-8 溶液100 μL/孔，繼續培養1 h 后終止培養，于酶標儀450 nm 波長處讀取各孔A 值，取3個復孔的均值。實驗重復3 次。細胞存活率=A實驗組/A對照組×100%。繪制不同藥物濃度的細胞相對存活率曲線，計算DDP 對細胞的半數抑制濃度（IC50）。

4.蛋白質印跡法檢測Snai1、ERCC1、E-cadherin 蛋白表達：細胞以PBS 漂洗，加入細胞裂解液，冰浴震蕩30 min，4 ℃12 000 r/min 離心10 min（離心半徑7.5 cm），收集上清，BCA 法測定蛋白濃度。取30 μg 總蛋白上樣，蛋白變性后電泳，轉膜，封閉。分別加入Snai1 一抗（1∶1000 稀釋）、ERCC1一抗（1∶500 稀釋）、E-cadherin 一抗（1∶1000 稀釋）4 ℃孵育過夜，洗膜后加入1∶2000 稀釋的羊抗兔IgG（檢測Snai1、E-cadherin）或羊抗鼠IgG（檢測ERCC1），室溫孵育2 h，洗膜后加入ECL 試劑，暗室曝光，顯影，定影。以α-tubulin（1∶1000 稀釋）為內參照，應用Quantity One 4.4.0 凝膠圖像分析軟件分析目的蛋白相對表達量。

5.免疫熒光法檢測Snai1、ERCC1、E-cadherin蛋白表達：將0.3%明膠預處理玻片置入6 孔板中，每孔接種2×105個細胞，培養24 h 后取出玻片，冷丙酮固定30 min，山羊血清封閉1 h，Snai1 一抗（1∶100 稀釋）、ERCC1 一抗（1∶50 稀釋）、E-cadherin 一抗（1∶100 稀釋）4 ℃孵育過夜，熒光二抗（1∶75 稀釋）孵育1 h，DAPI（2 μg/mL）細胞核染色，l h 內熒光顯微鏡攝影。

三、統計學分析

結 果

一、SGC7901/DDP 細 胞Snai1、ERCC1、E-cadherin 蛋白表達變化

蛋白質印跡法檢測顯示，DDP 耐藥SGC7901/DDP 細胞中的Snai1、ERCC1 蛋白相對表達量分別增高至DDP 敏感親本SGC7901 細胞的（3.702±0.126）倍、（4.489±0.140）倍，E-cadherin 蛋白相對表達量降低至DDP 敏感親本SGC7901 細胞的（0.375±0.049）倍，差異均有統計學意義（P＜0.05）（見圖1）。

二、穩定轉染amiRNA-Snai1 的SGC7901/DDP細胞Snai1、ERCC1、E-cadherin 蛋白表達變化

蛋白質印跡法和免疫熒光法檢測顯示，穩定轉染amiRNA-Snai1 的SGC7901/DDP-amiRNA組 細胞，Snai1、ERCC1 蛋白相對表達量顯著低于轉染陰性對照質粒的SGC7901/DDP-Mock組細胞（Snai1:0.268±0.035 對0.947±0.049,P＜0.05;ERCC1:0.211±0.012 對0.925±0.033,P＜0.05），熒光強度較SGC7901/DDP組細胞明顯減弱；E-cadherin 蛋白相對表達量顯著高于SGC7901/DDP-Mock組細胞（1.591±0.186對0.979±0.022,P＜0.05），熒光強度較SGC7901/DDP組細胞明顯增強（見圖2、圖3）。

三、穩定轉染amiRNA-Snai1 對SGC7901/DDP細胞對DDP 敏感性的影響

經不同濃度（0.01、0.1、1.0、10.0 mg/L）DDP 作用24 h，穩定轉染amiRNA-Snai1 的SGC7901/DDPamiRNA組細胞相對存活率分別為82.43%±0.06%、55.06%±0.06%、16.59%±0.06%、6.68%±0.06%，IC50值為（0.116±0.017）mg/L；而經上述濃度DDP 作用的轉染陰性對照質粒的SGC7901/DDP-Mock組細胞，相對存活率分別為95.96%±0.05%、87.87%±0.07%、60.20%±0.08%、9.60%±0.06%，IC50值 為（2.344±0.155）mg/L。DDP 對SGC7901/DDP-amiRNA組細胞的IC50值顯著低于SGC7901/DDP-Mock組細胞（P＜0.05）（見圖4）。

圖4 穩定轉染amiRNA-Snai1 對SGC7901/DDP 細胞對DDP 敏感性的影響

討 論

在腫瘤的發生、發展過程中，腫瘤細胞可發生EMT，即上皮性腫瘤細胞失去極性，轉分化為具有運動能力的間質細胞[7]。EMT 使腫瘤細胞具有間質細胞表型，從而影響腫瘤的分化、侵襲、轉移等多種生物學行為，并使腫瘤對化療產生抵抗[4～6]。然而，EMT 的發生涉及多個信號通路和復雜的分子機制，其引起腫瘤耐藥的確切機制尚未完全闡明[8～10]。

鋅指轉錄因子Snail 家族是生物體內的一類堿性螺旋-環-螺旋（basic helix-loop-helix,bHLH）轉錄因子，其家族成員，尤其是Snai1 被認為是腫瘤細胞發生EMT 的重要調控因子，可通過與上皮細胞黏附分子E-cadherin 啟動子區的E-box 作用元件結合而抑制E-cadherin 基因轉錄，下調E-cadherin表達，使上皮細胞向間質細胞表型轉化，最終引起EMT[1,2]。本研究蛋白質印跡法檢測顯示，DDP 耐藥SGC7901/DDP 細胞中的Snai1 蛋白相對表達量較DDP 敏感親本SGC7901 細胞顯著增高，且有研究[11]發現抑制E-cadherin 可通過誘導EMT 增強腫瘤細胞的耐藥性，由此推測SGC7901/DDP 細胞中Ecadherin 蛋白呈低水平表達。本研究蛋白質印跡法檢測驗證了這一推測。

胃癌細胞株經DDP 誘導建立耐藥株后，其對DDP 的耐受性增強與細胞對DNA 損傷的修復能力增強有關，ERCC1 基因在其中起關鍵作用[12]。研究[13]顯示Snai1 可直接調節ERCC1 基因轉錄，通過上調ERCC1 表達促成腫瘤對DDP 耐藥。本研究蛋白質印跡法檢測證實DDP 耐藥SGC7901/DDP 細胞中的Snai1、ERCC1 蛋白相對表達量較DDP 敏感親本SGC7901 細胞顯著增高。

為進一步明確Snai1 及其調控的信號通路在胃癌多藥耐藥中的作用，本研究以amiRNA-Snai1沉默DDP 耐藥SGC7901/DDP 細胞的Snai1 基因表 達，通過觀察SGC7901/DDP 細胞中Snai1、Ecadherin、ERCC1 蛋白表達的變化及其對DDP 敏感性的變化，探討amiRNA-Snai1 逆轉SGC7901/DDP細胞對DDP 耐藥性的作用及其可能機制。蛋白質印跡法檢測顯示，穩定轉染amiRNA-Snai1 的SGC7901/DDP 細胞Snai1、ERCC1 蛋白相對表達量顯著降低，E-cadherin 蛋白相對表達量顯著增高，免疫熒光法檢測結果與蛋白質印跡法呈相同趨勢。DDP 對穩定轉染amiRNA-Snai1 SGC7901/DDP 細胞的IC50值顯著降低，表明amiRNA-Snai1 能增加SGC7901/DDP 細胞對DDP 的敏感性。

綜上所述，以amiRNA-Snai1 沉默Snai1 基因表達可能通過下調ERCC1 表達、上調E-cadherin表達而逆轉耐藥人胃癌細胞株SGC7901/DDP 對DDP 的耐藥性。由此提示Snai1 上調ERCC1 表達、下調E-cadherin 表達是胃癌細胞發生EMT、促成胃癌對DDP 耐藥的關鍵因素，這一發現為克服胃癌治療中的DDP 耐藥提供了新的研究思路。目前EMT 引起腫瘤耐藥的確切機制尚未完全闡明，逆轉腫瘤對DDP 耐藥的調控通路仍有待進一步研究。

1 Nieto MA.The snail superfamily of zinc-finger transcription factors[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2002,3(3):155-166.

2 Cano A,Pérez-Moreno MA,Rodrigo I,et al.The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression[J].Nat Cell Biol,2000,2 (2):76-83.

3 Medici D,Hay ED,Olsen BR.Snail and Slug promote epithelial-mesenchymal transition through beta-catenin-Tcell factor-4-dependent expression of transforming growth factor-beta3[J].Mol Biol Cell,2008,19 (11):4875-4887.

4 Haslehurst AM,Koti M,Dharsee M,et al.EMT transcription factors snail and slug directly contribute to cisplatin resistance in ovarian cancer[J].BMC Cancer,2012,12 (1):91.

5 Arumugam T,Ramachandran V,Fournier KF,et al.Epithelial to mesenchymal transition contributes to drug resistance in pancreatic cancer[J].Cancer Res,2009,69(14):5820-5828.

6 Saxena M,Stephens MA,Pathak H,et al.Transcription factors that mediate epithelial-mesenchymal transition lead to multidrug resistance by upregulating ABC transporters[J].Cell Death Dis,2011,2 (7):e179.

7 Thiery JP.Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression[J].Nat Rev Cancer,2002,2 (6):442-454.

8 Shah AN,Summy JM,Zhang J,et al.Development and characterization of gemcitabine-resistant pancreatic tumor cells[J].Ann Surg Oncol,2007,14 (12):3629-3637.

9 Rosanò L,Cianfrocca R,Spinella F,et al.Acquisition of chemoresistance and EMT phenotype is linked with activation of the endothelin A receptor pathway in ovarian carcinoma cells[J].Clin Cancer Res,2011,17 (8):2350-2360.

11 Chen X,Wang Y,Xia H,et al.Loss of E-cadherin promotes the growth,invasion and drug resistance of colorectal cancer cells and is associated with liver metastasis[J].Mol Biol Rep.2012 Feb 7.Epub ahead of print.

12 Li Q,Dang CX,Liu ZG,et al.ERCC1 expression is a predictor of survival in gastric cancer patients treated with surgery and adjuvant chemotherapy[J].Chinese-German Journal of Clinical Oncology,2011,10 (2):92-95.

13 Hsu DS,Lan HY,Huang CH,et al.Regulation of excision repair cross-complementation group 1 by Snail contributes to cisplatin resistance in head and neck cancer[J].Clin Cancer Res,2010,16 (18):4561-4571.