HPLC-ELSD 測定歸芪洋參丸中人參皂苷Rb1的含量

孟 霜，裴妙榮，李慧峰

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.山西中醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030024）

歸芪洋參丸為山西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院制劑，由西洋參、黃芪、山藥、生地黃、當(dāng)歸、蒼術(shù)、丹參等多味藥組成，具有補(bǔ)脾益肺、活血祛瘀等功效，用于脾胃虛弱，氣短咳嗽，氣滯血瘀等。該方中西洋參為君藥，因此選用西洋參作為質(zhì)量控制指標(biāo)。本制劑所含藥味比較多，成分復(fù)雜，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HPLC-ELSD 法對(duì)人參皂苷類成分能達(dá)到很好的分離，所以本實(shí)驗(yàn)選用HPLC-ELSD 法作為本制劑中人參皂苷Rb1含量測定的方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料

Waters2695（美國）高效液相色譜儀；Alltech 2000ES 蒸發(fā)光散射檢測器；十萬分之一天平（梅特勒公司）；EL204 萬分之一天平（上海精密儀器有限公司）；人參皂苷Rb1對(duì)照品（批號(hào)110704-200318）購于中國藥品生物制品鑒定所；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈-水（30∶70）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；ELSD 參數(shù)：漂移管溫度110 ℃，載氣流量2.1 L/min。理論塔板數(shù)按人參皂苷Rb1計(jì)算不低于5 000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取人參皂苷Rb1對(duì)照品適量，加甲醇制成0.916 g/L 的溶液，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取本品適量，研細(xì)，取約3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水飽和正丁醇50 mL，稱定重量，超聲處理（150 W，40 KHz）45 min，放冷，再稱定重量，用水飽和正丁醇補(bǔ)足減失的重量，濾過，精密量取25 mL 至分液漏斗中，用氨試液充分洗滌2 次，每次25 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙猓⒍哭D(zhuǎn)移至5 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得［1］。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取人參皂苷Rb1對(duì)照品溶液（0.916 g/L）0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL 于2 mL 容量瓶中，分別加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得不同濃度對(duì)照品溶液，按照2.1 色譜條件，分別進(jìn)樣20 μL 進(jìn)行測定。以人參皂苷Rb1進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)（X），峰面積積分值的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=1.452 9X+6.036 2，r=0.999 8。結(jié)果表明人參皂苷Rb1在1.832 μg～18.32 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 專屬性試驗(yàn)

取西洋參以外的其余藥味，按照制備工藝制成不含西洋參的空白制劑，然后按照供試品溶液的制備方法制得陰性對(duì)照。按照2.1 色譜條件進(jìn)行測定，進(jìn)樣量20 μL，結(jié)果在人參皂苷Rb1對(duì)照品相同保留時(shí)間處無干擾峰，表明其余藥味對(duì)人參皂苷Rb1的測定無干擾，結(jié)果見圖1。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取人參皂苷Rb1對(duì)照品溶液（0.916 g/L），按照2.1 色譜條件進(jìn)行測定，重復(fù)測定6 次，進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果人參皂苷Rb1峰面積積分值RSD 2.18%（n=6）。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，分別于配制后0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h 測定人參皂苷Rb1峰面積，進(jìn)樣量20 μL。結(jié)果人參皂苷Rb1峰面積積分值RSD 1.63%（n=6），表明供試品溶液在12 h 內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品，共6 份，分別按2.3 方法制得供試品溶液，照2.1 色譜條件進(jìn)行測定，進(jìn)樣量20 μL。結(jié)果制劑中人參皂苷Rb1的平均含量為1.08 mg/g，RSD 1.57%（n=6）。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品6 份，分別精密加入人參皂苷Rb1對(duì)照品溶液（4.100 g/L）0.5 mL，按2.3方法操作，制得供試品溶液，照2.1 色譜條件測定，進(jìn)樣量20 μL，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。回收率平均值為99.70%，RSD 1.90%。

表1 人參皂苷Rb1加樣回收率測定

2.10 樣品含量測定

取三批樣品分別制得供試品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液5μL、10 μL，供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀，按照2.1 色譜條件進(jìn)行測定，采用外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程計(jì)算人參皂苷Rb1含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品中人參皂苷Rb1含量測定結(jié)果 （mg/g）

3 討論

圖1 歸芪洋參丸HPLC 色譜圖

西洋參為本制劑的君藥，人參皂苷Rb1為其特征性有效成分，通過測定其含量可以有效地控制藥品的質(zhì)量。人參皂苷Rb1為四環(huán)三萜，作者曾試圖應(yīng)用2010 版《中國藥典》所載西洋參含量測定方法，在紫外檢測器203 nm 波長下，對(duì)人參皂苷Rb1進(jìn)行測定，但由于該成分為較弱的末端吸收，而本制劑處方大，藥味多，成分復(fù)雜，干擾嚴(yán)重，難以得到滿意的分離效果，故不能選用紫外檢測器。蒸發(fā)光散射檢測器為通用質(zhì)量型檢測器，其響應(yīng)不依賴樣品的光學(xué)性質(zhì)，基線噪音小［2-3］，能夠獲得較好的峰形，所以本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-ELSD 法作為制劑中人參皂苷Rb1含量測定的方法。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-ELSD 法測定西洋參中皂苷的含量，簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好。

［1］李永國，王崢濤.人參、西洋參質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究進(jìn)展［J］.中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2005，10（5）：10.

［2］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：122.

［3］趙宇新，李曼玲.蒸發(fā)光散射檢測器在中藥成分分析中的應(yīng)用［J］.中國中藥雜志，2003，28（10）：913.