RP-HPLC法測定人血漿中的替勃龍

趙燕燕,高茜，李月秋，韓媛媛，劉麗艷

(1.河北大學 醫學實驗中心，河北 保定 071000；2.河北大學 化學與環境科學學院，河北 保定 071002)

RP-HPLC法測定人血漿中的替勃龍

趙燕燕1,2,高茜2，李月秋1，韓媛媛1，劉麗艷1

(1.河北大學 醫學實驗中心，河北 保定 071000；2.河北大學 化學與環境科學學院，河北 保定 071002)

采用反相高效液相色譜法檢測人體血漿中替勃龍的含量.以5倍樣品體積的乙腈萃取2次，經氮氣吹干，甲醇溶解后，上機分析.采用Promosil-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，流動相：甲醇-乙腈-水，流速：1.0 mL/min，進樣量：10 μL，檢測波長：204 nm，柱溫：25 ℃.在優化的色譜條件下，替勃龍在0.5～250.0 μg/mL內線性關系良好(r=0.999 9)，最低檢測限為0.05 μg/mL，平均回收率(n=3)為92.7%，RSDs小于1.6%.本方法簡單，靈敏，準確，適合于體內替勃龍含量的檢測與分析.

高效液相色譜法；人體血漿；替勃龍

替勃龍(商品名：利維愛)，是一種新型的仿性腺甾體激素類藥物，被用于絕經后的激素替代治療[1].該產品口服后在體內發揮雌、雄、孕3種激素樣活性綜合作用[2]，臨床上常用于治療更年期或手術后絕經期婦女機能紊亂性疾病[3]，改善圍絕經期癥狀，防治心血管疾病和骨質疏松[4-5]、緩解抑郁癥狀[6]等.替勃龍體內含量分析常采用GC-MS，LC-MC[7-8]等方法，但質譜儀價格昂貴，一般實驗室不具備該條件，難以得到普遍推廣.Jadhav等[9]采用高效液相色譜法對替勃龍原料藥和片劑型中的含量進行了測定，有關體內生物樣品中痕量替勃龍的高效液相色譜檢測方法尚未見文獻報道.本實驗建立了血漿中痕量替勃龍含量檢測的反相高效液相色譜法，該方法簡單、靈敏、準確，且樣品處理過程簡單、回收率高，比文獻[9]報道的方法更加方便，成本低，毒性、污染小，能夠滿足體內痕量替勃龍含量的檢測與分析，為其臨床藥物治療及基礎研究提供了依據.

1 實驗部分

1.1儀器與設備

LC-10ATvp高效液相色譜儀、SPD-M10Avp二極管陣列檢測器(DAD)、CLASS-VP工作站(日本島津公司)；DELTA-320型酸度計(梅特勒-托利多儀器有限公司)；TGL-16G離心機(上海安亭科學儀器廠)；BS224S型電子分析天平(北京賽多利斯天平公司)；HGL-12A型氮吹儀(上海泉島科貿有限公司)；超純水機(重慶頤洋企業發展有限公司).

1.2材料與試劑

替勃龍對照品(北京紫竹藥業有限公司);甲醇(色譜純，天津市康科德科技有限公司);乙腈(色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；水為二次去離子水.

1.3實驗條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱:Promosil-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相:甲醇-乙腈-水(V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=50∶30∶20)；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL；柱溫25 ℃；檢測波長204 nm.

1.3.2 對照品儲備液配制

精確稱取替勃龍對照品，置于50 mL容量瓶中，加入甲醇使之溶解，用流動相定容，制成質量濃度為1 mg/mL的對照品儲備液，于4 ℃冰箱中保存，使用時用流動相逐級稀釋至所需濃度.

1.3.3 樣品處理

取健康體檢者空腹靜脈血2 mL，離心10 min(3 000 r/min)，按5倍樣品(血清)體積的比例加入蛋白沉淀劑乙腈，放置10 min，離心10 min(10 000 r/min)，取上清液.下層血清沉淀物按5倍樣品體積的比例加入蛋白沉淀劑乙腈，進行2次萃取離心，合并上清液，氮氣吹干，甲醇溶解殘渣，用0.45 μm濾膜過濾，上機分析.

2 結果與討論

2.1流動相的選擇

2.1.1 有機相中甲醇比例的選擇

實驗考察了以甲醇和水作為流動相時，改變甲醇的體積分數(60%，65%，70%，75%，80%，85%)對檢測靈敏度(圖1)和分離度(圖2)的影響.結果表明，隨著甲醇體積分數的增加，流動相對樣品的洗脫能力增強，保留時間縮短，峰型尖銳、對稱，靈敏度顯著增加.甲醇的體積分數大于80%時，樣品峰與雜質峰的分離度小于1.5，不利于分離.確定流動相為：甲醇-水(V(甲醇)∶V(水)=80∶20).

φ(甲醇)/% φ(甲醇)/%

2.1.2 有機相中甲醇與乙腈比例的選擇

固定有機相和水相的比例，考察了有機相中加入乙腈體積分數(12.5%，25%，37.5%，50%)對檢測靈敏度的影響，見圖3.結果表明，隨著有機相中乙腈量的增加，樣品峰和雜質峰分離無明顯改善，但其靈敏度顯著提高.當乙腈體積分數大于37.5%時，靈敏度不再有明顯變化.選擇有機相中乙腈的體積分數為37.5%，即流動相為：甲醇-乙腈-水(V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=50∶30∶20).

φ(乙腈)/%

2.2檢測波長的選擇

取替勃龍對照品溶液，在波長200～400 nm內進行紫外掃描.對照品溶液在204，245 nm處有紫外吸收，其中在204 nm處有最大吸收，故選204 nm作為檢測波長.

2.3樣品處理條件的選擇

實驗分別考察了體積分數為5%高氯酸、5%三氯乙酸、10%三氯乙酸、丙酮、乙腈、氯仿、甲醇對蛋白質的沉淀效果.結果表明，5%高氯酸、5%三氯乙酸、10%三氯乙酸對樣品的破壞程度較大，丙酮、氯仿、甲醇蛋白沉淀效果較差，乙腈蛋白沉淀效果最好.同時考察了樣品和乙腈的不同體積比例(1∶1，1∶3，1∶5)對蛋白質沉淀效果的影響.結果表明，當血清與乙腈以1∶5體積比混合時，采用二次萃取離心，合并上清液，氮氣吹干的方法，血清中的蛋白沉淀效果最好，峰型對稱，雜質峰干擾最小，回收率最高.

2.4方法專屬性實驗

分別取2份同一樣本血漿各100 μL，一份血漿作為對照，加入500 μL乙腈,另一份加入替勃龍對照品，然后加入500 μL乙腈，分別按照1.3.3節方法處理后上機分析，色譜圖見圖4.

2.5線性關系和檢出限

精確量取替勃龍對照品儲備液，用流動相稀釋，得到一系列質量濃度不同的溶液，按照1.3.1節色譜條件進樣分析，以進樣質量濃度X(μg/mL)對峰面積Y作圖，繪制標準曲線.按3倍信噪比(S/N)計算最低檢出限(LOD).

替勃龍的線性方程：Y=8 872.75X+5 638.04，(r=0.999 9)，線性范圍0.5～250.0 μg/mL，檢出限0.05 μg/mL.

2.6方法的精密度

取6份同一樣本血漿，分別加入一定量的替勃龍對照品溶液，按照1.3.3節的方法處理，上機分析，各色譜峰的保留時間波動小于0.02 min，峰面積的RSD為0.3%(n=6).

2.7穩定性

在血漿中加入一定量的替勃龍對照品溶液，按照1.3.3節方法進行處理，分別在0，6，12，24，36，48，72 h時取樣進樣測定，結果表明樣品峰面積的RSD為0.9%(n=7)，說明制備好的樣品溶液在3 d內檢測穩定性良好.

2.8回收率

分別取9份同一樣本血漿各100 μL，分別加入高、中、低3種濃度的替勃龍對照品溶液各3份，按照1.3.3節方法處理后上機分析，平均回收率為92.7%.替勃龍的加標回收率見表1.

表1 人體血漿中替勃龍的加標回收率(n=3)

2.9人血漿中替勃龍含量的測定

按照1.3.3節方法對血漿樣品進行處理后上機分析，色譜圖見圖4 c.

a.對照品溶液(250 μg/mL)；b.空白血漿；c.含藥血漿(250 μg/mL).

3 結論

采用乙腈作為蛋白沉淀劑對樣品進行處理，同時對下層沉淀物進行二次萃取離心，合并上層液后氮氣吹干，用甲醇溶解后上機分析，大大提高了樣品回收率.本實驗建立的RP-HPLC法，在單一流動相、單流速、等度洗脫條件下取得良好檢測效果.本方法簡單、靈敏、準確，適合于體內替勃龍含量的檢測與分析，為其臨床藥物治療及基礎研究提供了依據.

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(責任編輯：梁俊紅)

Methodfordetectionoftiblloneinhumanplasmabyreversed-phasehighperformanceliquidchromatography

ZHAOYan-yan1，2，GAOQian2,LIYue-qiu2,HANYuan-yuan1,LIULi-yan1

(1.Experimental Center of Medicine, Hebei University, Baoding 071000, China; 2.College of Chemistry and Environmental Science , Hebei University, Baoding 071002, China)

A method of reversed-phase high performance liquid chromatography (RF-HPLC) was developed for the determination of tibolone in the plasma of people.The samples were extracted twice with 5 times voloum of acetonitrile.After the solvent was removed with nitrogen, the residues were dissolved in methanol.The separation column was Promosil-C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm) and the mobile phase wasV(methanol)∶V(acetonitrile)∶V(water)(50∶30∶20), The flow rate was 1.0 mL/min, The injection volume was 10 μL and the detection wavelength was set at 204 nm, The column temperature was 25 ℃.Under the optimized separation conditions, the calibration curves showed good linearity within the concentrations of 0.5-250.0 μg/mL(r=0.999 9), The limit of detection was 0.05 μg/mL, The average recovery (n=3) was 92.7%, and the RSDs were less than 1.6%.This method is simple, sensitive and accurate, and suitable for the determination of tibolone in biological samples.

HPLC；human plasma；tibolone

O657.7

A

1000-1565(2012)01-0047-05

2011- 09-10

河北省科技攻關項目(05276101D-88)；河北省教育廳科學研究計劃項目(2009315)；河北省衛生廳醫學科學研究重點課題計劃項目(20090570)；河北省中醫藥管理局科研計劃課題(2008072)

趙燕燕(1960-)，女，天津人，河北大學教授，博士，主要從事藥理學以及將現代分離技術用于臨床、藥學、食品、環境等方面的研究工作.

E-mail：zhaoyany606@tom.com