不同途徑給予重組人腸三葉因子對燒傷后小鼠腸黏膜屏障功能的影響＊

王 煥，吳修文，吳 煒，張 勇，萬千雪，金 星，徐淑秀△，彭 曦▲

（1.蚌埠醫學院護理系，安徽蚌埠233030；2.第三軍醫大學西南醫院全軍燒傷研究所／創傷、燒傷與復合傷國家重點實驗室，重慶400038）

燒傷應激、缺血、缺氧和過度炎癥反應可導致腸道組織結構受損，腸黏膜屏障破壞，腸腔中的細菌、毒素可穿越腸黏膜，是形成燒傷后“腸源性感染”和“腸源性高代謝”的病理生理基礎[1]。因此，如何減輕嚴重創傷后腸黏膜損傷，加速腸黏膜修復是目前燒傷救治中的重要環節。盡管已有采用生長激素、胃腸肽及生長因子治療燒傷后胃腸損害的報道，但這些藥物特異性不強，穩定性不高，胃腸道給藥療效不佳[2]，臨床使用受限。腸三葉因子（intestinal trefoil factor，ITF）是由腸道杯狀細胞特異分泌的小分子多肽，因其具有特殊的“三葉草”型空間結構，非常穩定，具有耐酸堿和蛋白酶消化的特性[3]。在腸易激綜合征、潰瘍性結腸炎、短腸綜合征等消化系統疾病的治療中ITF的療效已得到肯定[4]。但ITF是否能減輕燒傷后腸道損傷還鮮見報道，對ITF最佳給藥途徑也還不甚清楚。本研究擬采用燒傷小鼠模型，觀察給予重組人ITF（rhITF）對燒傷后腸道損傷的保護作用，并比較口服灌胃和皮下注射兩種給藥途徑在療效上的差異，為今后rhITF用于燒傷后腸黏膜的修復奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 動物模型

1.1.1 燒傷模型的制作及分組 健康成年BALB／c小鼠104只，體質量（23±3.1）g，雌雄不限（第三軍醫大學附屬大坪醫院實驗動物中心提供）。隨機分成4組，正常對照（control，C）組（n＝8）、燒傷對照（burned，B）組（n＝32）、口服灌胃rhITF（intragastric administration，IG）組（n＝32）和皮下注射rhITF（subcutaneous injection，SC）組（n＝32）。實驗分燒傷前及燒傷后1、3、5、7 d 4個時相點。C組8只小鼠，其他各組每個時相點各8只小鼠。C組小鼠不予燒傷，其他3組小鼠燒傷前禁食12 h，1%戊巴比妥鈉（40 mg／kg）腹腔麻醉，背部電推剃毛，稱質量后置剃毛區于80℃，水浴20 s，造成30%體表面Ⅲ度燒傷。傷后按40 mL／kg腹腔注入復方乳酸鈉抗休克。創面涂2%碘酊抗感染，每天2次，傷后給予標準動物顆粒飼料喂養，自由飲水。

1.1.2 藥物來源及給藥方式 rhITF來源于本課題組的前期制備，采用畢赤酵母重組表達發酵，獲得的rhITF經驗證與理論值完全相符，毒理學實驗已證實該重組蛋白毒副作用非常輕微。IG組小鼠在傷后2 h開始rhITF灌胃，劑量為1.0 mg／kg，每次灌胃容量為0.5 mL，每天分2次給藥；在SC組小鼠頸部皮下注射等劑量的rhITF，每次注射容量為0.1 mL，每天2次。

1.2 檢測指標

1.2.1 腸黏膜通透性測定 采用核素標記蛋白法，經尾靜脈注入锝99標記的二乙三胺五乙酸螯合的人血清蛋白（99Tcm－diethylene triamine pentaacetic acid－human serum albumin，DTPA－HAS），劑量為1 480 kBq／kg，30 min后斷頭處死小鼠，測定腸腔灌洗液的放射性每分鐘計數值，以正常小鼠腸黏膜通量為1，用燒傷后各時相的放射性每分鐘計數值與之的比值來反映腸黏膜通透性的改變。由于99Tcm半衰期僅6 h，實驗中要設衰變對照，校正所測放射性每分鐘計數值。

1.2.2 腸上皮細胞增殖指數測定 采用流式細胞檢測技術，分離腸上皮細胞，調節細胞數為1×105個，75%乙醇固定，棄固定劑，PBS洗2次，加5 mg／mL的RNA酶0.5 mL，混勻，37℃水浴30 min，加50μg／mL的碘化丙啶染色液0.5 mL，搖勻，避光冷藏30 min，上機檢測，每份標本分析1萬個細胞。據G1、S、G2及M各期細胞所占百分比，計算增殖指數（S＋G2＋M）。

1.2.3 血漿二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）活性測定 采用分光光度法，具體操作如下：每管中加入0.1 mol／L PBS 1.5 mL（p H 7.2），50μL辣根過氧化物酶（2μg），50μL鄰聯茴香胺（250μg），250μL血漿，最后加50μL尸胺（87.5μg），充分混勻后置37℃水浴30 min。測定波長為436 nm。以上試劑除辣根過氧化物酶由深圳晶美公司提供外，其余均購自Sigma公司。

1.2.4 病理形態學檢查 取所需時相點動物部分回腸（距回盲部10 cm），置10%甲醛液中固定。常規石蠟包埋切片HE染色。用Olympus顯微鏡觀察病理切片。

1.2.4.1 黏膜損害指數評價標準 采用Ogura記分法，0分：腸黏膜絨毛正常；1分：絨毛頂端上皮下出現囊狀間隙，并伴有毛細血管充血；2分：上皮下間隙擴大，中度固有層水腫，中央乳糜管擴張；3分：固有層明顯水腫，腸黏膜上皮層細胞變性、壞死，少數絨毛頂端脫落；4分：上皮細胞層變性、壞死、脫落，部分絨毛脫落，固有層裸露，毛細血管擴張、充血；5分：絨毛脫落，固有層崩解，出血或潰瘍形成。光鏡下每只小鼠腸道標本隨機計數10個視野，取平均值。

1.2.4.2 腸黏膜厚度測定 采用目鏡測微器測定法，在40倍光鏡下每張切片隨機測定6個視野黏膜厚度，取平均值作為小鼠腸黏膜厚度。

1.3 統計學處理 應用SPSS13.0統計軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，組間比較采用多因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

4組小鼠腸黏膜損傷指數、腸黏膜通透性、血漿DAO活性、腸黏膜細胞增殖指數和黏膜厚度見表1～5。

表1 C組及燒傷后小鼠不同時相點腸黏膜損傷指數比較（±s）

表1 C組及燒傷后小鼠不同時相點腸黏膜損傷指數比較（±s）

＊：P＜0.05，與B組比較；△：P＜0.05，與SC組同一時相點比較；－：表示無數據。

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表2 C組及燒傷后小鼠不同時相點腸黏膜通透性變化比較（±s）

表2 C組及燒傷后小鼠不同時相點腸黏膜通透性變化比較（±s）

＊：P＜0.05，與B組同一時相點比較；△：P＜0.05，與SC組同一時相點比較；－：表示無數據。

組別0d 1 d 3 d 5 d 7 d B組－3.15±0.32 2.36±0.28 2.15±0.14 2.35±0.16 SC組－3.23±0.21 2.23±0.29 1.77±0.13＊1.72±0.14＊IG組－3.25±0.35 1.68±0.25＊1.35±0.12＊△1.17±0.16＊C組1.0－－－－△

表3 C組及燒傷后小鼠不同時相點血漿DAO活性變化比較（±s，U／mL）

表3 C組及燒傷后小鼠不同時相點血漿DAO活性變化比較（±s，U／mL）

＊：P＜0.05，與B組同一時相點比較；△：P＜0.05，與SC組同一時相點比較；－：表示無數據。

組別0d 1 d 3 d 5 d 7 d B組－1.88±0.32 1.73±0.19 1.43±0.17 0.98±0.12 SC組－1.75±0.28 1.59±0.22 1.12±0.16＊0.62±0.10＊IG組－1.92±0.20 1.45±0.16＊0.95±0.12＊△0.58±0.08＊△C組0.42±0.02－－－－

表4 C組及燒傷后小鼠不同時相點腸黏膜細胞增殖指數的變化（±s，%）

表4 C組及燒傷后小鼠不同時相點腸黏膜細胞增殖指數的變化（±s，%）

－：表示無數據。

組別0d 1 d 3 d 5 d 7 d B組－41.23±8.96 37.25±8.50 46.48±9.25 49.45±7.80 SC組－42.58±11.24 38.24±9.25 47.59±7.50 52.48±9.55 IG組－44.20±12.25 42.23±8.90 52.45±8.82 55.25±9.40 C組61.34±6.82－－－－

表5 C組及小鼠燒傷后不同時相點腸黏膜厚度比較（±s，μm）

表5 C組及小鼠燒傷后不同時相點腸黏膜厚度比較（±s，μm）

＊：P＜0.05，與B組同一時相點比較；△：P＜0.05，與SC組同一時相點比較；－：表示無數據。

組別0d 1 d 3 d 5 d 7 d B組－323.56±22.40 310.50±20.40 239.44±22.15 195.26±18.80 SC組－346.25±25.46 323.45±25.68 276.78±20.10＊252.45±21.15＊IG組－339.50±28.18 345.66±12.80 308.40±21.50＊△332.10±22.50＊△C組366.67±31.02－－－－

3 討 論

腸道是燒傷后缺血、缺氧性損害的主要靶器官之一，被譽為外科應激的中心器官。燒傷后受損腸道的修復機制比較復雜，涉及腸上皮細胞增殖和移行等多個環節。生長因子在腸道損傷修復過程中發揮了重要作用，在眾多生長因子中，ITF似乎更具有特異性。首先ITF是腸道杯狀細胞特異分泌的小分子多肽，其他部位少見；其次，ITF具有特殊的“三葉草型”空間結構，使之具備了蛋白酶消化抗性和酸堿穩定性，使其能在胃腸道復雜的環境中不被破壞，保持生物活性[3]；此外，ITF空間結構中的一些特殊位點還能同黏蛋白中的寡聚糖或多糖的側鏈相連，維護腸黏膜屏障[5]。因此，ITF被譽為胃腸道的“超級保護因子”。

實驗結果顯示，燒傷可導致腸道組織結構受損，通透性增加，修復能力降低，黏膜萎縮。rhITF能顯著降低燒傷后腸道受損程度，SC組和IG組小鼠腸道損傷指數和血漿DAO活性明顯低于B組。與之對應，腸黏膜通透性明顯下降，腸道萎縮程度也有所減輕，說明rhITF具有較強的生物活性，能有效降低燒傷后腸道受損程度，減輕黏膜萎縮，降低腸黏膜通透性。實驗結果還顯示，ITF促進腸道修復的機制與細胞增殖無關，無論是灌胃還是皮下注射rhITF對燒傷后腸上皮細胞增殖受抑均無明顯療效，說明ITF通過其他途徑促進受損腸道修復。體外實驗證實，ITF對細胞增殖活性影響不大，但能明顯促進細胞移行[6]，本實驗再次證實ITF對細胞增殖無效。增殖和移行是腸黏膜修復的主要方式，在受損腸道的修復中起重要作用，其中，細胞移行不涉及細胞DNA復制和蛋白合成，是腸黏膜的快速修復機制[7]，越來越受到重視。ITF主要通過促進細胞移行加快損傷黏膜的修復，而對細胞增殖能力影響不明顯，降低了使用生長因子不當造成的細胞過度增生，甚至發生癌變的風險，較之其他生長因子安全性更高，具有成為胃腸黏膜特異保護藥物的潛質，值得重點研究和開發。

實驗結果還顯示，無論哪種途徑給予rhITF對減輕燒傷后腸道損傷，維護腸黏膜屏障都有積極意義。相對而言，通過灌胃方式給藥的療效更佳，這可能與胃腸道直接給藥有利于維護腸黏膜屏障有關。ITF的空間結構中有與黏蛋白中糖鏈結合的特異位點，能增加黏蛋白的穩定性，能穩定腸黏液層，減輕燒傷后腸道損傷，促進黏膜修復[3]。此外，腸上皮細胞膜上具有ITF特異受體[8]，通過胃腸道給藥可能有利于ITF與其受體結合，啟動腸道細胞保護機制，促進受損腸道修復，但其內在的信號機制目前尚不甚清楚，有待進一步研究。

總之，給予外源性ITF能有效減輕燒傷后腸道損傷，維護腸黏膜屏障，在沒有絕對口服用藥禁忌的情況下，應優先考慮通過胃腸道給藥。

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