大鼠肌腱愈合過程中BMP－12、BMP－13和BMP－14基因表達(dá)水平的變化

尹良軍，羅小輯，黃 偉，陳 亮，胡 寧，何百成，羅進(jìn)勇，左國偉，He Tongchuan＃，鄧忠良△

（重慶醫(yī)科大學(xué)：1.附屬第二醫(yī)院骨科 400010；2.附屬第一醫(yī)院骨科 400046；3.藥學(xué)院 400060；4.檢驗系生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點實驗室 400060）

肌腱是肌腹兩端的索狀或膜狀致密結(jié)締組織，由形態(tài)相似的梭形肌腱細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）構(gòu)成。肌腱細(xì)胞是肌腱組織的基本功能單位，它合成和分泌Ⅰ型膠原（collagenⅠ，ColⅠ）等細(xì)胞外基質(zhì)，維持肌腱組織的新陳代謝。有研究認(rèn)為，肌腱修復(fù)過程即肌腱成纖維細(xì)胞增殖、遷移并分泌ECM的過程，該過程中有多種生長因子有序表達(dá)并調(diào)控肌腱的修復(fù)。生長因子是由細(xì)胞產(chǎn)生的，能調(diào)節(jié)自身和其他細(xì)胞功能小分子可溶性蛋白質(zhì)或多肽，通過與受體特異性的結(jié)合啟動其效應(yīng)作用。它可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化過程并改變細(xì)胞產(chǎn)物的合成，從而對創(chuàng)傷后組織愈合的復(fù)雜過程進(jìn)行調(diào)控。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）家族是調(diào)控骨骼生長發(fā)育的一類重要生長因子，也是調(diào)控骨和軟骨修復(fù)和再生的重要因子。近年來，有研究提示，BMP－12、BMP－13、BMP－14在肌腱愈合過程中可能發(fā)揮重要作用，但其作用特點和機制尚不夠清楚[1－3]。現(xiàn)將本研究大鼠肌腱愈合過程中BMP－12、BMP－13和BMP－14基因表達(dá)水平的變化情況報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇7周齡無特定病原（specific pathogen free，SPF）級SD雄性大鼠56只，體質(zhì)量（200±25）g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。生產(chǎn)許可證號：SCXK（渝）20020002，使用許可證號：SCXK（渝）20020001。實驗過程中對實驗動物的處置符合中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》標(biāo)準(zhǔn)[4]。

1.2 主要試劑和儀器 Trizol（Gibco公司），The Cells－to－cDNAⅡkit（Ambion公司），Takara PCR Amplification Kit（大連Takara公司），SYBR Premix Ex Taq試劑盒（大連Takara公司）。實時熒光定量PCR（real－time quantitative PCR，qRTPCR）引物如下（Invitrogen公司合成）：cyclophilin－A F：5′－CGA GCT CTG AGC ACT GGA GA－3′；cyclophilin－A R：5′－TGG CG TGT AAA GTC ACC ACC－3′；BMP－12F：5′－GCT GGG ACG ACT GGA TCA－3′；BMP－12R：5′－TGA GCA GCG TCT GGA TGA－3′；BMP－13F：5′－AAG CGA CAC GGC AAG AAG－3′；BMP－13R：5′－CGC AGT GAT AGG CCT CGT－3′；BMP－14F：5′－GCT CTG GCC AGG ATG ACA－3′；BMP－14R：5′－ACT GCA GCG AGC CTT GAG－3′。主要儀器包括CO2培養(yǎng)箱（美 國Thermo公 司）、Eppendorf PCR儀、qRT－PCR儀Mx3000P（美國Stratagene公司）。

1.3 跟腱創(chuàng)傷修復(fù)模型的建立 將56只SD大鼠均使用麻醉機面罩給氧和異氟醚麻醉成功后，做右后爪的后中線切口，縱行切開腱鞘，辨明跟腱和跖肌腱，在肌肉肌腱移行部和跟骨止點的中點處橫行切斷跟腱，然后使用單股的6－0 Prolene（普理靈）線做Kessler－Kirchmeyer法縫合跟腱斷端。縫合腱鞘及手術(shù)切口。腹腔內(nèi)注射丁丙諾啡（50μg／kg）進(jìn)行術(shù)后的疼痛控制。手術(shù)后的大鼠成對飼養(yǎng)，允許進(jìn)食、飲水和自由移動，每天觀察直到處死。

1.4 標(biāo)本的獲取 分別在術(shù)后第1、3、5、7、14、21、28天處死大鼠8只。取右側(cè)跟腱作為實驗組的標(biāo)本，左側(cè)跟腱作為對照組的標(biāo)本。

1.5 BMP－12、BMP－13、BMP－14表達(dá)水平的檢測 切下肌肉肌腱交界處至肌腱跟骨止點處之間的肌腱部分。剪碎并在液氮中研磨成漿使用Trizol提取總RNA。按照試劑說明書進(jìn)行，獲得的RNA取少量測其濃度和純度（OD260／OD280＝2.0），其余置－80℃保存待用。按Taqman試劑盒要求，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，qRT－PCR反應(yīng)體系配制及擴增條件設(shè)置參照定量PCR反應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行（SYBR Primer Ex Taq kit，TAKARA）。每個樣本共重復(fù)檢測3次，以Cyclophilin－A作內(nèi)參，由實時熒光定量PCR儀（Mx3000P）自動給出c（t）值和目的基因的相對含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)分析，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

BMP－12、BMP－13和BMP－14基因在實驗組的各個時間點都有表達(dá)，見圖1。而在對照組沒有檢測到它們的表達(dá)。

圖1 實驗組的跟腱組織基因表達(dá)水平變化柱狀圖

3 討 論

BMP是一類生長和分化因子家族，屬于TGF－β超家族。BMP首先在脫鈣骨基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)，是一種多效性的形態(tài)發(fā)生蛋白，具有趨化性、濃度依賴性、促有絲分裂和分化誘導(dǎo)的特性。在結(jié)構(gòu)方面，BMP是以二硫鍵相連的二聚體，這種結(jié)構(gòu)決定著BMP的生物學(xué)活性。目前已有超過15種BMP被克隆并在人和鼠體內(nèi)表達(dá)。BMP主要調(diào)控胚胎期肢體形態(tài)的發(fā)育，在成年動物體內(nèi)，BMP可在異位誘導(dǎo)骨與軟骨形成，調(diào)節(jié)骨與軟骨的排列、分化模式和方向。遺傳學(xué)研究顯示BMP還在除骨之外的其他組織內(nèi)發(fā)揮作用[5－6]。能夠誘導(dǎo)動物或人體間充質(zhì)細(xì)胞分化為骨、軟骨、韌帶、肌腱和神經(jīng)組織，同時對細(xì)胞增殖、分化、凋亡起重要調(diào)控作用。

BMP－12、BMP－13、BMP－14是BMP中有同源序列的 一組，又分別稱為生長分化因子（growth differentiation factor，GDF）－7、GDF－6、GDF－5。有研究顯示，大鼠肌肉內(nèi)注射GDF－7、GDF－6、GDF－5可誘導(dǎo) 肌腱或者韌帶樣組織形成[1]。大鼠GDF－5缺失可出現(xiàn)跟腱超微結(jié)構(gòu)、組織構(gòu)成和生物力學(xué)完整性的改變[7]。

Chhabra等[8]研究發(fā)現(xiàn)，肌腱損傷的GDF－5缺陷老鼠跟腱愈合延遲1～2周；跟腱細(xì)胞中DNA、黏多糖及膠原含量達(dá)峰值時間較對照組延遲5～9 d，且峰值明顯低于對照組；新生血管形成也較對照組延遲約1周，且損傷修復(fù)部位有更多脂肪細(xì)胞形成。這提示GDF－5在細(xì)胞聚集、遷移、分化、增殖和血管形成中起重要作用，在肌腱愈合的早期起重要作用。Rickert等[9]用腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)GDF－5基因至大鼠跟腱細(xì)胞，8周后大鼠跟腱修復(fù)較對照組（局部注射生理鹽水）明顯增厚，同時可見大量新生軟骨組織形成。Dines等[10]將大鼠肌腱橫斷后縫合，然后用含明膠和重組人GDF（recornbinant human GDF，rhGDF）－5涂層的縫線植入肌腱縫合處。3周后觀察發(fā)現(xiàn)實驗組肌腱修復(fù)速度增快，肌腱的最大抗拉力和強度明顯增強。同時發(fā)現(xiàn)圍繞縫線有少量軟骨形成。Bolt等[11]采用局部注射可表達(dá)BMP－14的重組腺病毒促進(jìn)大鼠損傷跟腱修復(fù)，觀察2周后發(fā)現(xiàn)，BMP－14使創(chuàng)傷跟腱斷端間的縫隙減少，出現(xiàn)大量新生肌腱細(xì)胞，縫合處拉伸強度較對照組提高70%。組織學(xué)檢查證實肌腱組織中未出現(xiàn)異位骨和軟骨組織形成。Kuroda等[12]在大鼠的股骨缺損處放置BMP－12的質(zhì)粒，2周后缺損處主要為纖維樣肌腱／韌帶組織填充，8周后缺損處才出現(xiàn)骨組織的替代。而在大鼠的股骨缺損處放置BMP－2的質(zhì)粒，修復(fù)過程一直以骨組織再生為主。說明BMP－12和BMP－2的生物學(xué)效應(yīng)不同，主要是調(diào)控肌腱細(xì)胞的發(fā)育。Majewski等[13]觀察到肌腱愈合時間顯著縮短，愈合質(zhì)量顯著改善。BMP－12作用下，肌腱的早期組織再生很明顯，導(dǎo)致創(chuàng)傷跟腱的快速修復(fù)和生物力學(xué)性能的改善。Haddad－Weber等[2]觀察到干細(xì)胞向肌腱樣細(xì)胞的分化和細(xì)胞外富含膠原的韌帶樣基質(zhì)的形成。

上述研究表明，BMP－12、BMP－13、BMP－14具有BMP家族其他成員類似的特性，不僅在特定組織的發(fā)育中起重要作用，還能夠顯著促進(jìn)特定組織創(chuàng)傷的修復(fù)。在本研究中，大鼠跟腱在沒有創(chuàng)傷修復(fù)反應(yīng)的情況下沒有明顯的BMP－12、BMP－13、BMP－14基因表達(dá)；而創(chuàng)傷后，BMP－12、BMP－13、BMP－14基因表達(dá)水平均顯著提高。提示這3種基因均參與肌腱修復(fù)反應(yīng)。BMP－13、BMP－14基因表達(dá)主要在創(chuàng)傷后第1～5天顯著增高，在創(chuàng)傷后第7天BMP－13、BMP－14基因表達(dá)水平顯著下降至低水平維持，提示BMP－13、BMP－14基因主要介導(dǎo)肌腱創(chuàng)傷修復(fù)的早期反應(yīng)。創(chuàng)傷后1～3 d為組織的炎癥反應(yīng)期，7～14 d為組織的增生反應(yīng)期，28 d為組織的塑形期。因此，本研究結(jié)果可能進(jìn)一步提示BMP－13和BMP－14基因主要對肌腱創(chuàng)傷修復(fù)過程中的炎癥反應(yīng)起重要作用，也可能對后續(xù)一些特定基因的表達(dá)起開關(guān)作用，而對肌腱的增生和后期塑形作用較小。BMP－12基因表達(dá)在創(chuàng)傷后第1～7天顯著增高，在第14～28天BMP－12基因進(jìn)入一個更高表達(dá)的平臺期。提示BMP－12參與肌腱創(chuàng)傷修復(fù)過程中的早期炎癥反應(yīng)，在肌腱細(xì)胞的增生和肌腱組織的晚期塑形中更發(fā)揮著重要的作用。

在肌腱發(fā)育過程中，BMP－12、BMP－13、BMP－14的功能各有不同，但是可能存在一定的互補性。Mikic等[3]在GDF－7缺失大鼠中觀察到鼠尾肌腱束的生化成分，如collⅠ、colⅢ、colⅤ等無明顯改變，力學(xué)強度也無明顯變化。qRT－PCR顯示GDF－7缺失大鼠的鼠尾肌腱組織中GDF－5基因表達(dá)比野生型大鼠提高50%，提示GDF－7基因缺失可以由GDF－5基因表達(dá)增高來代償，兩者的功能存在很大程度的代償性。在GDF－7缺失大鼠的肌腱中GDF－6基因表達(dá)也比野生型大鼠增高，但是增高程度沒有GDF－5明顯[14]。

組織再生是創(chuàng)傷組織修復(fù)的重要手段，在肌腱創(chuàng)傷后修復(fù)過程中，BMP－12、BMP－13、BMP－14的功能可能也存在一定程度的互補性。在肌腱修復(fù)早期三者同時高表達(dá)，但是后期以BMP－12基因表達(dá)為主，提示BMP－12可能是目前發(fā)現(xiàn)的在韌帶／肌腱形成、發(fā)育和創(chuàng)傷修復(fù)中最關(guān)鍵的細(xì)胞因子。

[1]Wolfman NM，Hattersley G，Cox K，et al.Ectopic induction of tendon and ligament in rats by growth and differentiation factors 5，6，and 7，members of the TGF－beta gene family[J].J Clin Invest，1997，100（2）：321－330.

[2]Haddad－Weber M，Prager P，Kunz M，et al.BMP－12 and BMP－13 gene transfer induce ligamentogenic differentiation in mesenchymal progenitor and anterior cruciate ligament cells[J].Cytotherapy，2010，12（4）：505－513.

[3]Mikic B，Entwistle R，Rossmeier K，et al.Effect of GDF－7 deficiency on tail tendon phenotype in mice[J].J Orthop Res，2008，26（6）：834－839.

[4]中華人民共和國科技部.關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見[EB／OL].（2009－09－03）[2011－09－25].http：／／www.most.gov.cn／fggw／zfwj／zfwj2006／zf06wj／zf06bfw／200609／t20060930＿54196.htm.

[5]Umulis D，O′Connor MB，Blair SS.The extracellular regulation of bone morphogenetic protein signaling[J].Development，2009，136（22）：3715－3728.

[6]Helbing T，Rothweiler R，Ketterer E，et al.BMP activity controlled by BMPER regulates the proinflammatory phenotype of endothelium[J].Blood，2011，118（18）：5040－5049.

[7]Mikic B，Schalet BJ，Clark RT，et al.GDF－5 deficiency in mice alters the ultrastructure，mechanical properties and composition of the Achilles tendon[J].J Orthop Res，2001，19（3）：365－371.

[8]Chhabra A，Tsou D，Clark RT，et al.GDF－5 deficiency in mice delays Achilles tendon healing[J].J Orthop Res，2003，21（5）：826－835.

[9]Rickert M，Wang H，Wieloch P，et al.Adenovirus－mediated gene transfer of growth and differentiation factor－5 into tenocytes and the healing rat Achilles tendon[J].Connect Tissue Res，2005，46（4／5）：175－183.

[10]Dines JS，Weber L，Razzano P，et al.The effect of growth differentiation factor－5－coated sutures on tendon repair in a rat model[J].J Shoulder Elbow Surg，2007，16（5 Suppl）：S215－221.

[11]Bolt P，Clerk AN，Luu HH，et al.BMP－14 gene therapy increases tendon tensile strength in a rat model of Achilles tendon injury[J].J Bone Joint Surg Am，2007，89（6）：1315－1320.

[12]Kuroda S，Goto N，Suzuki M，et al.Regeneration of boneand tendon／ligament－like tissues induced by gene transfer of bone morphogenetic protein－12 in a rat bone defect[J].J Tissue Eng，2010，2010：891049.

[13]Majewski M，Betz O，Ochsner PE，et al.Ex vivo adenoviral transfer of bone morphogenetic protein 12（BMP－12）cDNA improves Achilles tendon healing in a rat model[J].Gene Ther，2008，15（16）：1139－1146.

[14]Mikic B，Bierwert L，Tsou D.Achilles tendon characterization in GDF－7 deficient mice[J].J Orthop Res，2006，24（4）：831－841.