羥基紅花黃色素A對氧化低密度脂蛋白誘導的血管平滑肌細胞增殖的抑制作用

盛 林，畢少杰，焦 波，馬偉紅

(1.山東大學第二醫院心內科，山東濟南 250033;2.山東大學藥學院藥理室，山東濟南 250012)

血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)增殖是動脈粥樣硬化、高血壓和介入治療后血管再狹窄的共同病理基礎[1]。氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoproteins，ox-LDL)可以損傷血管內皮細胞，刺激VSMC增殖或者誘導凋亡，導致動脈粥樣硬化斑塊穩定性下降[2－3]。近年研究還發現ox-LDL與冠狀動脈介入治療后血管再狹窄關系密切[4]。紅花黃色素(safflor yellow)是從傳統活血化瘀中藥紅花中提取而來，為多種水溶性查耳酮成分的混合物，被認為是紅花中的主要有效成分。紅花黃色素可進一步分離為紅花黃色素A、紅花黃色素B、紅花黃色素 C，其中羥基紅花黃色素 A(hydroxyl-safflor yellow A，HSYA)被認為是紅花黃色素中含量最高的黃酮成分，也是紅花發揮藥理作用的主要物質。由于HSYA具有抗心肌缺血、抑制血小板聚集、抗栓和抗氧化等作用，可以有效緩解心絞痛發作，因而廣泛應用于臨床。有文獻報道紅花黃色素可以抑制VSMC增殖[5]，但是紅花黃色素能否抑制ox-LDL誘導VSMC增殖，目前尚未見報道。本實驗通過ox-LDL誘導VSMC增殖，探討HSYA抑制VSMC增殖的信號調節機制。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

HSYA，純度98%，分子式:C27H32O16，由山東省天然藥物工程技術研究中心現代中藥研究室提供;DMEM培養基和胰蛋白酶:Gibco公司;胎牛血清:杭州四季青公司;磷酸化細胞外信號調節激酶1/2(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2，p-ERK1/2)單克隆抗體、絲裂原活化的蛋白激酶磷酯酶-1(mitogen-activated provein kinase phosphatase-1，MKP-1)單克隆抗體均為美國Cell Signal Technology公司產品;β肌動蛋白HRP標記羊抗兔IgG為晶美生物工程有限公司;β微管蛋白HRP標記羊抗兔IgG為美國Santa Cruz公司產品;PD98059為Sigma-Aldrich公司產品;發光底物(SuperSignal Western Pico Chemiluminescence Substrate)，美國 Pierce公司產品;牛血清白蛋白、碘化丙啶(propidium iodide，PI)為美國Amresco公司產品;N，N，N，N-四甲基乙二胺(N，N，N，N-tetramethylethylenediamine，TEMED)、過硫酸銨(ammonium persulfate，APS)、RNase均為美國Sigma公司產品;考馬斯亮藍、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺均為美國Bio Basic Inc.BBI公司產品;CO2細胞培養箱(美國Forma Scientific，Inc.公司);熒光顯微鏡(日本Olympus公司);酶聯免疫檢測儀(Multiskan Mk3，上海雷伯分析儀器有限公司);流式細胞儀(BD FACS Calibur);PCR儀系MT Research INC產品;DYY-Ⅲ6型穩壓穩流電泳儀，上海醫療儀器廠產品;電泳及轉膜裝置(美國Bio-Rad公司);ox-LDL為北京欣源佳和生物科技公司;無水乙醇為天津市天新化學試劑開發中心產品。

1.2 細胞培養

SD大鼠由山東大學第二醫院實驗動物中心提供，許可證號:SYXK(魯)20050050。取150 g左右雄性大鼠胸主動脈，剝去血管外膜，刮除內膜，剪成1 mm×1 mm組織塊，貼于培養瓶內，于37℃，5%CO2條件下用含20%胎牛血清的DMEM培養液進行培養，3～5 d換液1次。待60%～80%融合時，加入0.25%胰蛋白酶消化傳代，4～6 d傳代。細胞為梭形，長成致密細胞層時出現典型的“峰-谷”狀結構。實驗用第3～8代VSMC。

1.3 細胞分組處理

取1.2項培養的細胞，根據預實驗結果，采用ox-LDL最佳刺激細胞增殖濃度35 mg·L－1和HSYA最佳抑制細胞增殖濃度 10 μmol·L－1進行實驗，按照下述進行分組處理:正常對照組細胞用含0.5%胎牛血清DMEM 培養液培養，ox-LDL 35 mg·L－1組，HSYA 10 μmol·L－1+ox-LDL 35 mg·L－1組，PD9805910 μmol·L－1+ox-LDL 35 mg·L－1和PD9805910 μmol·L－1+HSYA 10 μmol·L－1+ox-LDL 35 mg·L－1組。細胞與藥物共同培養48 h。

1.4 MTT 法檢測細胞存活率[6]

取指數生長期細胞，經PBS洗滌后，用0.25%胰蛋白酶消化分散成單個細胞。取細胞接種于96孔培養板中，細胞數為每孔1×103個。置37℃，5%CO2孵箱中培養24 h，細胞貼壁后加入ox-LDL，每組6個復孔。繼續培養24 h取培養板，經洗滌加入20 μl MTT 5 g·L－1，培養 4 h，去除培養液，加入DMSO后即在570 nm處測吸光度值(absorbance，A)，細胞存活率(%)=A處理組/A正常對照組×100%。

1.5 流式細胞儀檢測細胞增殖周期

按1.2分組處理后用0.25%胰蛋白酶消化成單細胞懸液，收集于離心管中，4℃，2000×g離心6 min，吸去上清，加入PBS洗滌2次，離心后棄上清，每管加入0.5 ml預冷的70%乙醇固定，4℃冰箱過夜。取出固定細胞，4℃，2000×g離心6 min，除去乙醇，加入預冷PBS洗滌2次，離心。每管樣品中加入 537 μl PBS 和3 μl RNase，37℃孵育30 min。每管中加入60 μl PI染液，避光反應30 min，轉移至流式管中于流式細胞儀檢測。

1.6 逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測MKP-1 mRNA和ERK1 mRNA轉錄表達

將VSMC在24孔板中傳代培養，按上述方法培養至終點。吸出培養液加入Trizol試劑，嚴格按照Gibco Trizol試劑盒說明書進行操作，提取VSMC總RNA。提取 10 μl RNA，冰上依次加入 0.2 μl Oligo dT 500 mg·L－1，2.5 μl dNTP(10 mmol·L－1)，0.5 μl M-MLV 逆轉錄酶2 MU·L－1，4 μl RT(5 × )，0.5 μl RNasin 4 kU·L－1，加三蒸水將總體積補至 20 μl 。然后37℃水浴 30 min，95℃ 10 min，0℃放置 5 min。置于－20℃冰箱備用。取逆轉錄產物5 μl作為擴增模板，分別加入 0.5 μl 上游引物 50 mmol·L－1，0.5 μl下 游 引 物 50 mmol· L－1，1 μldNTP 10 mmol·L－1，0.5 μl Taq 酶 5 kU·L－1，5 μl PCR 緩沖液(10 ×)，5 μl MgCl225 mmol·L－1，加三蒸水將總體積補至50 μl。放入PCR擴增儀，95℃預變性，并按以下條件擴增30個循環:91.6℃45 s，57℃60 s，72℃60 s，最后72℃延伸5 min。MKP-1序列為上游5'-TCTGGATTGTCGCTCCTTCT-3'，下游 5'-GTCTGCCTTGTGGTTGTCC T-3'，擴增產物長度為 619 bp;ERK1引物序列為上游5'-ACACATGCTTTGGGTCCTTC-3'，下游 5'-AGGAACAGCTCACAGCCCTA-3'，擴增產物長度為883 bp;GAPDH引物序列為上游5'-CATCACCATCTTCCAGGAGCA-3'，下游 5'-TGACCTTGCCCACAGCCTTG-3'，擴增產物長度443 bp。取PCR擴增產物行瓊脂糖凝膠電壓電泳，采用復日FR-980A生物電泳圖像分析儀進行瓊脂糖凝膠掃描和擴增條帶積分吸光度(integrated absorbance，IA)分析。以與內參GAPDH的IA比值表示MKP-1和ERK1mRNA的相對表達強度。

1.7 Western印跡法測定ERK1/2和MKP-1蛋白表達

取對數生長期細胞，以1×108L－1的密度接種于6孔板中，37℃，5%CO2恒溫培養箱中培養至90%融合，收集1.3處理的細胞，冰PBS洗滌3次，在冰浴條件下加入適量裂解液裂解細胞，14000×g離心15 min，小心吸取上清，BCA試劑測定蛋白含量，取40 μg蛋白樣品上樣 ，以10%SDS-PAGE凝膠電泳分離(積層膠80 mV，分離膠120 mV)后電泳轉移(150 mA，1.5 h)至PVDF膜上，麗春紅染色觀察蛋白質轉移情況。5%的脫脂奶粉封閉1 h后，分別以兔抗 MKP-1(1∶1000)，ERK1/2(1∶1000)單克隆抗體 4℃孵育過夜，TBST洗脫后，二抗(1∶5000)室溫下孵育1h后，電化學發光免疫分析(ECL)顯色。用GIS圖像處理系統分析目的條帶的蛋白濃度，計算各蛋白條帶和內參照的比值。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 HSYA對ox-LDL誘導大鼠主動脈VSMC增殖的影響

表1結果顯示，與正常對照組相比，ox-LDL 35 mg·L－1組 VSMC 存活率明顯增高，增加了 1.7倍，加入 HSYA 10 μmol·L－1后，細胞增殖受到明顯抑制，細胞存活率降低了 60.4%(P＜0.01);加入ERK1/2特異性抑制劑 PD9805910 μmol·L－1，細胞存活率降低了58.3%(P＜0.01)。HSYA 10 μmol·L－1和 PD9805910 μmol·L－1同時加入細胞存活受到進一步抑制，細胞存活率下降了61.9%(P＜0.01)。HSYA 10 μmol·L－1，PD9805910 μmol·L－1單用或兩藥合用對細胞存活的作用無顯著性差異。

Tab.1 Effect of hydroxyl-safflor yellow A(HSYA)on vascular smooth muscle cell survival stimulated by oxidized low-density lipoprotein(ox-LDL)by MTT assay

2.2 HSYA對ox-LDL誘大鼠主動脈VSMC周期的影響

表2和圖1流式細胞術分析結果顯示，與正常對照組相比，ox-LDL 35 mg·L－1組G0/G1期細胞下降了30.2%，S期細胞數增加了1.9 倍(P＜0.01)。加入 HSYA 10 μmol·L－1可顯著抑制ox-LDL誘導細胞增殖周期，停滯于 G0/G1期的 VSMC(79.8±9.5)%(P＜0.05)。加入 PD9805910 μmol·L－1使(75.0±8.3)%的細胞停滯于G0/G1期(P＜0.01)。PD98059和HSYA同時加入VSMC增殖周期進一步受到抑制，G0/G1期細胞增加至(83.0±11.40)%，S期細胞減少至(17.0±2.6)%(P＜0.01)。HSYA，PD98059單用或兩者合用對細胞周期的作用無顯著差異。

Tab.2 Effect of HSYA on cell cycle in VSMC stimulated by ox-LDL

2.3 HSYA對ERK1和MKP-1基因表達的影響

Fig.1 Effect of HSYA on cell cycle in VSMC stimulated by ox-LDL.See Tab.1 for the treatment.A:normal control;B:ox-LDL 35 mg·L －1;C:ox-LDL 35 mg·L －1+HSYA 10 μmol·L －1;D:ox-LDL 35 mg·L －1+PD9805910 μmol·L －1;E:ox-LDL 35 mg·L －1+PD9805910 μmol·L －1+HSYA 10 μmol·L －1 .

Fig.2 Effect of HSYA on ERK1mRNA and MKP-1mRNA expression in VSMC stimulated by ox-LDL.See Tab.1 for the treatment.B was the semiquantitative result of A.1.control;2.HSYA;3.ox-LDL;4.ox-LDL+HSYA;5.ox-LDL+PD98059;6.ox-LDL+PD98059+HSYA.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with normal control;#P＜0.05，##P＜0.01，compared with ox-LDL;△P＜0.05，compared with PD98059+ox-LDL.

圖2 結果顯示，HSYA 10 μmol·L－1對正常細胞ERK1和MKP-1基因表達無影響。與正常對照組相比，ox-LDL 35 mg·L－1組 VSMC ERK1 mRNA 表達量明顯增高了2.2倍(P＜0.01)，MKP-1 mRNA表達雖然也略有增加，但無顯著差異。與ox-LDL組相比，加入 HSYA 10 μmol·L－1，ERK1 mRNA 表達量下降了42.2%(P＜0.01)，MKP-1 mRNA表達顯著增高，增加了 86.9%(P＜0.01);加入 PD9805910 μmol·L－1ERK1 mRNA 下降了45.9%(P＜0.01)，MKP-1 mRNA表達無明顯差異;PD98059與HSYA同時加入，ERK1 mRNA表達進一步明顯下降(P＜0.01)，且與單用藥組有顯著差異(P＜0.05)，MKP-1 mRNA顯著增加，增加了110%(P＜0.01)，且顯著強于PD98059單獨作用組(P＜0.01)。

2.4 HSYA對 p-ERK1/2和 MKP-1蛋白表達的影響

圖3結果顯示，與正常對照相比，ox-LDL模型組p-ERK1/2顯著增加，增加了33.3%(P＜0.01)，MKP-1蛋白略有減少，但無顯著差異。與ox-LDL模型組相比，HSYA 10 μmol·L－1組 p-ERK1/2 表達減少了39.9%(P＜0.01)，MKP-1蛋白表達增加了80.6%(P＜0.01);PD9805910 μmol·L－1組p-ERK1/2表達下降了45.9%(P＜0.01)，MKP-1 蛋白表達增加了21.1%，但無顯著差異;HSYA與PD98059同時加入，p-ERK1/2表達下降了51.2%(P＜0.01)，MKP-1 表 達 增 加 了 62.4%(P＜0.01)。

Fig.3 Effect of HSYA on the p-ERK1/2 and MKP-1 protein expression ofVSMC stimulated by ox-LDL 35 mg·L －1.See Tab.1 for the legend.B was the semiquantitative result of A.1.normal control;2.ox-LDL;3.ox-LDL+HSYA;4.ox-LDL+PD98059+HSYA;5.ox-LDL+PD98059.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with normal control group;##P＜0.01，compared with ox-LDL group;△P＜0.05，compared with ox-LDL+PD98059 group.

3 討論

本研究結果表明，ox-LDL 35 mg·L－1可以顯著增強ERK1/2基因轉錄和蛋白表達，推動細胞周期運行，刺激 VSMC 增殖。HSYA 10 μmol·L－1可以顯著增強MKP-1基因轉錄和蛋白表達，抑制p-ERK1/2活性，通過誘導VSMC生長停滯在G0/G1期抑制ox-LDL刺激VSMC增殖。使用ERK1/2選擇性抑制劑PD98059后，ox-LDL刺激ERK1/2表達和VSMC增殖的活性受到顯著抑制，而 MKP-1表達不受PD98059影響，進一步證明ox-LDL刺激VSMC增殖是通過的ERK1/2信號轉導通路，與MKP-1活性無明顯關系。HSYA和PD98059與ox-LDL共培養的研究結果證明，HSYA可以顯著增強細胞MKP-1基因轉錄和蛋白表達。

ERK1/2是細胞內調節細胞生長的最重要的信號蛋白激酶之一，包括生長因子、血管緊張素Ⅱ和內皮素等在內的許多刺激因子均通過活化ERK1/2促進 VSMC 增殖[7－8]。MKP-1 是 ERK1/2 的負性調控蛋白，通過脫磷酸化作用MKP-1可以滅活ERK1/2活性。因此，調控ERK1/2和(或)MKP-1表達將對VSMC增殖產生重要影響。ox-LDL對VSMC的生物學效應與其濃度有關，低濃度刺激細胞增殖而高濃度則誘導凋亡。研究表明，ox-LDL可以通過活化Ras/Raf/絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶(mitogenactivated protein kinase kinase kinase，MEK)/ERK1/2信號轉導通路和誘導細胞周期蛋白D1表達刺激VSMC 增殖[9－13]。本研究顯示，ox-LDL 顯著增強ERK1 mRNA轉錄和磷酸化ERK1/2蛋白活性，推動VSMC由細胞周期G0/G1期向S/G2-M期轉變，證實激活ERK1/2是ox-LDL刺激VSMC增殖的基本機制。MKP-1是 ERK1/2的負性調控蛋白，然而ox-LDL刺激細胞增殖與MKP-1表達變化是否有關，HSYA抑制ox-LDL刺激VSMC增殖是否也與MKP-1表達變化有關目前尚未見報道。本研究結果表明，ox-LDL在增強ERK1/2活性的同時并沒有增加MKP-1轉錄和蛋白表達，因此，ox-LDL刺激VSMC增殖與 MKP-1并不相關，而可能是直接刺激ERK1/2轉錄，增強其磷酸化蛋白表達。

本實驗結果還表明，ERK1/2選擇性抑制劑PD98059是通過降低ERK1/2基因轉錄和p-ERK1/2表達抑制ox-LDL誘導VSMC增殖的，而對于MKP-1的基因轉錄與蛋白表達沒有影響。與PD98059不同，HSYA在顯著降低p-ERK1/2活性的同時明顯增強了MKP-1基因轉錄和蛋白表達。因此，HSYA抑制細胞增殖的機制可能是由于通過增強MKP-1表達抑制了p-ERK1/2及其下游信號細胞周期蛋白D1活性，進而抑制細胞周期G0/G1期向S/G2-M期轉變的結果。這可能是HSYA抑制ox-LDL誘導VSMC增殖的一個新的重要機制。

[1]Curcio A，Torella D，Indolfi C.Mechanisms of smooth muscle cell proliferation and endothelial regeneration after vascular injury and stenting:approach to therapy[J].Circ J，2011，75(6):1287-1296.

[2]Stoll G，Bendszus M.Inflammation and atherosclerosis:novel insights into plaque formation and destabilization[J].Stroke，2006，37(7):1923-1932.

[3]Imazu M，Ono K，Tadehara F，Kajiwara K，Yamamoto H，Sumii K，et al.Plasma levels of oxidized low density lipoprotein are associated with stable angina pectoris and modalities of acute coronary syndrome[J].Int Heart J，2008，49(5):515-524.

[4]Naruko T，Ueda M，Ehara S，Itoh A，Haze K，Shirai N，et al.Persistent high levels of plasma oxidized lowdensity lipoprotein after acute myocardial infarction predict stent restenosis[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006，26(4):877-883.

[5]Qiu ZC，Xu JL，Chen YX，Cui JC.Effect of safflor yellow on rat vascular smoth muscle cells[J].Hunan J Tradit Chin Med(湖南中醫雜志)，2005，21(4):75-77.

[6]Brunt KR，Fenrich KK，Kiani G，Tse MY，Pang SC，Ward CA，et al.Protection of human vascular smooth muscle cells from H2O2-induced apoptosis through functional codependence between HO-1 and AKT[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006，26(9):2027-2034.

[7]Li Y，Lévesque LO，Anand-Srivastava MB.Epidermal growth factor receptor transactivation by endogenous vasoactive peptides contributes to hyperproliferation of vascular smooth muscle cells of SHR[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2010，299(6):H1959-H1967.

[8]Xiang Q， Lin G， Xu J， Zheng S，Chen S，Zhou K，et al.The role of caveolin1 and sprouty1 in genistein's regulation of vascular smooth muscle cell and endothelial cell proliferation[J].Eur J Pharmacol，2010，648(1-3):153-161.

[9]Perez J，Torres RA，Rocic P，Cismowski MJ，Weber DS，Darley-Usmar VM，et al.PYK2 signaling is required for PDGF-dependent vascular smooth muscle cell proliferation[J].Am J Physiol Cell Physiol，2011，301(1):C242-C251.

[10]Yang CM，Chiu CT，Wang CC，Chien CS，Hsiao LD，Lin CC，et al.Activation of mitogen-activated protein kinase by oxidized low-density lipoprotein in canine cultured vascular smooth muscle cells[J].Cell Signal，2000，12(4):205-214.

[11]Watanabe T， Takahashi K， Kanome T， Hongo S，Miyazaki A，Koba S，et al.Human urotensin-Ⅱ potentiates the mitogenic effect of mildly oxidized low-density lipoprotein on vascular smooth muscle cells:comparison with other vasoactive agents and hydrogen peroxide[J].Hypertens Res，2006，29(10):821-831.

[12]Chahine MN， Blackwood DP， Dibrov E，Richard MN，Pierce GN.Oxidized LDL affects smooth muscle cell growth through MAPK-mediated actions on nuclear protein import[J].J Mol Cell Cardiol，2009，46(3):431-441.

[13]Tu YS，Yan PK，Zhu BY，Huang HL，Liao DF.Probucol reduces cyclin D1protein expression and G1→S transition in rat vascular smooth muscle cells[J].Chin J Arterioscler(中國動脈硬化雜志)，2005，13(6):676-680.