LW-AFC對飲食和鏈佐星聯(lián)合誘導糖尿病大鼠的治療作用

徐智宇，遲曉麗，馬 淵，周文霞，張永祥

(軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所中藥和神經(jīng)免疫藥理學研究室，北京 100850)

六味地黃湯(Liuweidihuang decoction，LW)是滋補腎陰的經(jīng)典名方，由熟地、山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮和白茯苓以 8∶4∶4∶3∶3∶3的質量比例配伍組成，主治腰膝酸軟、頭暈目眩、耳聾耳鳴、盜汗自汗、發(fā)熱、瘦弱、小便淋秘和口渴失音等腎陰不足之證。糖尿病癥狀與傳統(tǒng)醫(yī)學中消渴病基本一致，患者陰津虧耗，陰損及陽，導致氣陰兩傷和陰陽俱虛。因此，消渴病常以主治腎陰虛的LW為基礎方。現(xiàn)代臨床醫(yī)學研究也表明，LW對糖尿病有較好的療效[1]。目前現(xiàn)有的LW制劑幾乎都是粗制劑，缺乏可靠的質量控制方法。本課題組以免疫和內分泌活性評價為導向，從LW中分離獲得了多糖、寡糖和糖苷等活性物質并按一定比例組成復方，即LW-AFC。本研究觀察LW-AFC對飲食和鏈佐星(streptozocin，STZ)聯(lián)合誘導的糖尿病模型大鼠的肥胖、糖脂代謝紊亂和胰島素抵抗的治療作用，以期為LW-AFC作為防治糖尿病的新藥研發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物、試劑和儀器

SPF級 Wistar大鼠，雄性，180～220 g，由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，動物合格證號:SCXK-(軍)2002-001，12 h光照/12 h黑暗，室溫23～25℃，相對濕度50%～70%，自由攝食和飲水。二甲雙胍(metformin，Met)，北京四環(huán)制藥有限責任公司，國藥準字H11020127;LW-AFC由本室制備，經(jīng)過濾、減壓濃縮和滅菌后保存于4℃?zhèn)溆肹2]，根據(jù)預實驗結果，LW-AFC 0.28，0.56 和1.12 g·kg－1，臨用前用蒸餾水配制成相應濃度的溶液。STZ、檸檬酸(FM=192.14)和檸檬酸鈉(FM=294.10)系美國Sigma公司產品，臨用前將檸檬酸和檸檬酸鈉溶液混合配制成pH4.0的緩沖液，過濾除菌后與STZ配制成相應濃度的注射液;葡萄糖、總膽固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)和甘油三酯(triglycerides，TG)測定試劑盒，北京中生北控有限責任公司;胰島素放射免疫分析試劑盒，北京北方生物技術研究所;高熱量飼料，中國醫(yī)學科學院動物研究所提供，由酪蛋白(25.8%)、D-L-蛋氨酸(0.4%)、麥芽糊精(16.2%)、蔗糖(8.9%)、纖維素(6.5%)、豬油(35%)、復合礦物質(1.5%)、一水合檸檬酸鉀(2.1%)、磷酸鈣鹽(1.7%)和復合維生素(1.3%)等成分組成，每100 g飼料可提供524.3 kcal的能量。Sn-69513型免疫計數(shù)器，上海核所日環(huán)光電儀器有限公司;Napco2200型37℃恒溫箱，美國Napco公司。POLARstar Galaxy多功能酶標儀，德國BMG公司。

1.2 動物分組、模型制備和給藥

Wistar大鼠適應性飼養(yǎng)后，按體質量隨機分為正常對照組(12只)和模型組(70只)。正常對照組大鼠每天飼以標準飼料，模型組每天飼以高熱量飼料，飲食誘導共持續(xù)5周。隨后模型組大鼠過夜禁食12 h后一次性 ip給予 STZ 30 mg·kg－1。

注射STZ 1周后模型組大鼠測定空腹血糖，血糖＞16.65 mmol·L－1的大鼠(約為 85%)按血糖和體質量隨機平均分為 5個組，即模型組、Met 0.2 g·kg－1、LW-AFC 0.28、0.56 和 1.12 g·kg－1，每組12只。大鼠分組后分別ig給予蒸餾水、Met或LW-AFC，每天1次，連續(xù)8周。除正常對照組飼以標準飼料外，其余各組大鼠均繼續(xù)以高熱量飼料喂食。給藥期間每2周動態(tài)監(jiān)測空腹血糖、胰島素、TC、LDL-C和 TG水平，并計算胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)。HOMA-IR是反映胰島素抵抗狀態(tài)的重要指標。HOMA-IR=空腹血糖(mmol·L－1)×胰島素(mIU·L－1)/22.5。大鼠采血前過夜禁食12 h，采血后恢復飲食。采集的血液在室溫靜置60 min后，1500×g 4℃離心30 min，分離血清在 －20℃低溫保存，備用。給藥結束后處死大鼠，稱取腹腔、腎囊和睪丸處脂肪，檢測內臟脂肪質量(visceral fat mass，VFM)，并計算內臟脂肪系數(shù)(visceral fat coefficient，VFC)，以反映腹型肥胖水平。VFC=VFM(g)/體質量 (g)×100%。

1.3 相關血清生化指標的測定

葡萄糖、TC和TG采用酶比色法檢測[3]，LDL-C采用清除法檢測[4]，胰島素采用放射免疫分析法檢測[5]。其中胰島素采用雙孔法檢測，每孔100 μl血清，檢測結果取算數(shù)平均值得到最終結果。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 LW-AFC對糖尿病大鼠肥胖的影響

表1可見，與正常對照組比較，模型組大鼠VFM和VFC均明顯升高(P＜0.01)，呈現(xiàn)出腹型肥胖。與模型組比較，Met 0.2 g·kg－1，LW-AFC 0.56和1.12 g·kg－1給藥8周均可顯著降低VFM 和VFC(P＜0.05)，表明LW-AFC可改善腹型肥胖。

Tab.1 Effect of LW-AFC on obesity formation in diabetic model rats

2.2 LW-AFC對糖尿病大鼠糖代謝的影響

2.2.1 LW-AFC對糖尿病大鼠空腹血糖的影響

與正常對照組相比，模型組大鼠空腹血糖顯著升高(P＜0.01)。與模型組比較，Met 0.2 g·kg－1在8 周的給藥周期內均可明顯降低空腹血糖(P＜0.01);LW-AFC 3個劑量給藥4～8周亦可明顯降低空腹血糖(P＜0.05，P＜0.01)，改善糖代謝紊亂(表2)。

Tab.2 Effect of LW-AFC on fasting blood glucose level in diabetic model rats

2.2.2 LW-AFC對糖尿病大鼠胰島素水平的影響

與正常對照組相比，模型組大鼠胰島素水平在2和6周時明顯升高(P＜0.05)，4周時則顯著降低;LW-AFC在給藥4和6周時與模型組比較胰島素水平明顯降低(表3)。

2.2.3 LW-AFC對糖尿病大鼠胰島素抵抗指數(shù)的影響

與正常對照組相比，模型組大鼠HOMA-IR在2～8周明顯升高(P＜0.01)，形成明顯而穩(wěn)定的胰島素抵抗。與模型組相比，Met在給藥后2～8周可明顯降低HOMA-IR(P＜0.01);LW-AFC 3個劑量給藥4～8周亦可顯著降低HOMA-IR(P＜0.01)，改善胰島素抵抗狀態(tài)(表4)。

2.3 LW-AFC對糖尿病大鼠脂代謝的影響

2.3.1 LW-AFC對糖尿病大鼠總膽固醇的影響

與正常對照組相比，模型組TC水平在4～8周明顯升高(P＜0.01)，呈現(xiàn)出嚴重的脂代謝紊亂。與模型組相比，Met給藥6～8周可明顯降低TC水平，LW-AFC 3個劑量給藥4～8周亦可明顯降低TC水平(P＜0.05)，改善高膽固醇血癥(表5)。

Tab.3 Effect of LW-AFC on fasting blood insulin level in diabetic model rats

Tab.4 Effect of LW-AFC on homeostasis model assessment of insulin resistance(HOMA-IR)of diabetic model rats

2.3.2 LW-AFC對糖尿病大鼠低密度脂蛋白膽固醇的影響

與正常對照組相比，模型組LDL-C水平在2，6和8周明顯升高(P＜0.05)。與模型組相比，Met給藥8周，LW-AFC 3個劑量給藥2～8周可持續(xù)穩(wěn)定地降低LDL-C水平(P＜0.05)，改善脂代謝紊亂(表6)。

2.3.3 LW-AFC對糖尿病大鼠甘油三酯的影響

由表7可見，與正常對照組相比，模型組TG水平在2周明顯升高(P＜0.01)，在4～8周無明顯變化。與模型組相比，LW-AFC 0.56 和1.12 g·kg－1給藥2周可顯著降低TG水平(P＜0.05)。

Tab.5 Effect of LW-AFC on total cholesterol(TC)level of diabetic model rats

Tab.6 Effect of LW-AFC on low density lipoprotein-cholesterol(LDL-C)of diabetic model rats

Tab.7 Effect of LW-AFC on triglycerides(TG)of diabetic model rats

3 討論

既往研究表明，腹型肥胖患者較整體型肥胖患者其代謝障礙和心血管疾病發(fā)生率更高[6]，并已成為心腦血管病變的最重要的獨立危險因素之一[7]。同時，鑒于脂質異位沉積已成為誘發(fā)胰島素抵抗重要的因素之一[8－9]，內臟脂肪水平增加對內分泌系統(tǒng)糖脂代謝紊亂起到了越來越重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，模型大鼠的體質量有所下降，與文獻報道一致[10]。但VFM和對照組相比仍然明顯增加，此外VFC亦明顯升高，上述實驗結果提示，模型大鼠呈現(xiàn)出嚴重的腹型肥胖。給予LW-AFC 0.56和1.12 g·kg－18周可以顯著降低模型大鼠的VFM和VFC，改善腹型肥胖。這種腹型肥胖的改善可能對胰島素抵抗的緩解和改善[11－12]、炎癥反應[13]及動脈粥樣硬化[14]等糖尿病并發(fā)癥的防治都具有重要和積極的意義。

胰島素抵抗和(或)胰島β細胞分泌障礙是糖尿病的主要病理特征，而胰島素抵抗又是2型糖尿病整個發(fā)病過程中的核心環(huán)節(jié)。本研究觀察到模型組大鼠在2～8周的實驗周期內表現(xiàn)出以穩(wěn)定的高血糖和胰島素抵抗為特征的糖代謝紊亂。給予LWAFC 4～8周可顯著降低血糖并明顯改善胰島素抵抗狀態(tài)，提示LW-AFC對飲食和STZ聯(lián)合誘導的糖尿病大鼠高血糖和胰島素抵抗均具有明顯的改善作用。LW-AFC對胰島素抵抗表現(xiàn)出明顯的改善作用，提示LW-AFC可能通過促進外周組織利用葡萄糖，從而降低血糖，并增加胰島素受體的數(shù)量和功能發(fā)揮作用，間接降低了胰島素的需求量，使機體分泌胰島素的水平下降，但具體作用機制有待進一步研究。

本研究觀察到正常對照組大鼠胰島素水平存在波動現(xiàn)象，可能與胰島素測定方法不是非常穩(wěn)定有關。本研究采用放射免疫分析法檢測胰島素，從方法學上看，采用放免法檢測胰島素比酶聯(lián)免疫法靈敏度高，但受不同批次試劑盒同位素標記水平存在差異的影響，批間誤差較大。在本研究中，為了隨時獲得實驗過程中血糖和胰島素水平，以動態(tài)了解模型指標變化和藥物的效應，本研究對各周次的指標采取了采血完成后立即進行檢測的方法，因此實驗期間胰島素水平波動較大。大鼠胰島素的基礎值一般在 15～56 mIU·L－1之間波動[15－17]，本研究結果與文獻報道基本是一致的，尚在可接受的范圍內。本課題組在實驗后期采用了瘦素基因缺乏的自發(fā)遺傳性糖尿病小鼠——ob/ob小鼠作為模型動物對LW-AFC的藥理作用進行了進一步的深入研究。ob/ob小鼠由于瘦素缺乏，進而表現(xiàn)出明顯的高胰島素血癥和胰島素抵抗，給予LW-AFC對ob/ob小鼠的高胰島素血癥和胰島素抵抗均具有明顯的改善作用(待發(fā)表)。

胰島素抵抗還可以誘發(fā)以高血脂為代表的脂代謝紊亂。胰島素抵抗導致胰島素抑制血漿中脂肪酸的作用降低，脂肪酸濃度升高，并最終分解為LDL-C。高胰島素血癥通過興奮交感神經(jīng)，刺激α-受體使脂蛋白脂酶減少，而脂蛋白脂酶的主要作用是降低肝臟極低密度脂蛋白的分泌，增加極低密度脂蛋白的清除。因此，胰島素抵抗進一步導致極低密度脂蛋白濃度的升高。此外，胰島素抵抗還可以通過使LDL-C受體活性下降和高密度脂蛋白合成受阻等多條途徑進一步加重脂代謝紊亂。本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血清TC和LDL-C水平明顯升高，形成了嚴重的脂代謝紊亂。LW-AFC給藥2～8周可不同程度地顯著降低TC和LDL-C，改善糖尿病大鼠的脂代謝紊亂。本研究亦發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠TG水平在注射STZ后2周顯著升高，在6～8周則恢復至正常對照組水平，提示模型組未能形成穩(wěn)定的高TG血癥。有文獻報道，TG的升高出現(xiàn)在造模2～3周內[18]，此后可降低甚至恢復至對照組水平，其具體機制有待進一步研究。LW-AFC給藥2周可以顯著降低TG水平。本課題組在后期實驗中也采用ob/ob小鼠觀察了LW-AFC對其脂代謝的影響，實驗期間各周次ob/ob小鼠的TG水平均顯著升高且沒有大的波動，給予LW-AFC對ob/ob小鼠的高TG血癥具有明顯的改善作用(待發(fā)表)。

現(xiàn)有研究表明，高血脂癥與引起糖尿病并發(fā)癥的主要因素——動脈粥樣硬化的關系十分密切[19－20]。在糖尿病的臨床治療過程中，《美國膽固醇教育計劃成人治療組第三次指南(NCEP ATPⅢ)》[21]，將各項血脂指標中的LDL-C作為最主要調脂靶點，其主要的理由為高膽固醇血癥，特別是LDL-C增高仍為致冠心病和動脈粥樣硬化最重要的血脂改變[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，LW-AFC對LDL-C的改善作用非常明顯，不但起效時間早，而且作用也較持久。據(jù)此初步推測，LW-AFC在改善糖脂代謝紊亂的同時對動脈粥樣硬化也可能具有潛在的預防作用。

上述研究結果表明，LW-AFC可同時改善糖尿病模型大鼠的腹型肥胖、降低血糖和血脂水平，并改善胰島素抵抗狀態(tài)。其中對腹型肥胖和LDL-C的改善作用提示其可能對糖尿病并發(fā)癥具有一定的預防作用。因此，LW-AFC用于防治糖尿病具有進一步研究開發(fā)的價值。

[1]Qi CH，Zhang YX，Shen BF.Advances in study on modern pharmacology of Liuwei Dihuang decoction[J].Bull Acad Mil Med Sci(軍事醫(yī)學科學院院刊)，2002，26(1):57-61.

[2]Zhang YX，Zhao YM.Research of Modern Pharmacology and Chemistry of Liuwei Dihuang Decoction(六味地黃湯現(xiàn)代藥理學與化學研究)[M].Beijing:Science Publishing Press，2006:209-217.

[3]Yin XM.Effects of Pyrrolidine Dithiocarbamate on islet β-cell apoptosis in type 2 diabetic rat(吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽對2型糖尿病大鼠胰島β細胞的凋亡作用)[D].Hebei Medical University.2011.

[4]Li DQ. Clinicalevaluation of two kinds of enzymatic clearance assay for determination of low-density lipoprotein cholesterol[J].J North Sichuan Med Coll(川北醫(yī)學院學報)，2004，19(1):98-100.

[5]Luo XJ，Lu HK，Gao CY，Lu JX，Gu CC，Jia WP.Comparative study of serum insulin immunoassays and its clinical significance[J].Chin J Endocrinol Metab(中華內分泌代謝雜志)，2009，25(6):622-625.

[6]Pi-Sunyer FX.The epidemiology of central fat distribution in relation to disease[J].Nutr Rev，2004，62(7 Pt 2):S120-S126.

[7]Pankow JS，Kwan DK，Duncan BB，Schmidt MI，Couper DJ，Golden S，et al.Cardiometabolic risk in impaired fasting glucose and impaired glucose tolerance:the Atherosclerosis Risk in Communities Study[J].Diabetes Care，2007，30(2):325-331.

[8]Lee Y，Lingvay I，Szczepaniak LS，Ravazzola M，Orci L，Unger RH.Pancreatic steatosis:harbinger of type 2 diabetes in obese rodents[J].Int J Obes(Lond)，2010，34(2):396-400.

[9]Zyromski NJ，Mathur A，Gowda GA，Murphy C，Swartz-Basile DA，Wade TE，et al.Nuclear magnetic resonance spectroscopy-based metabolomics of the fatty pancreas:implicating fat in pancreatic pathology[J].Pancreatology，2009，9(4):410-419.

[10]Wang BW，Li Y，Liu XH，Liu S，Sun CH.Effect of the duration of high-fat diet and the dosage of streptozotocin on establishing experimental animal model of type 2 diabetes mellitus[J].J Hyg Res(衛(wèi)生研究)，2011，40(1):99-102，106.

[11]Cai D，Yuan M，F(xiàn)rantz DF，Melendez PA，Hansen L，Lee J，et al.Local and systemic insulin resistance resulting from hepatic activation of IKK-beta and NF-kappaB[J].Nat Med，2005，11(2):183-190.

[12]Yudkin JS，Eringa E，Stehouwer CD."Vasocrine"signalling from perivascular fat:a mechanism linking insulin resistance to vascular disease[J].Lancet，2005，365(9473):1817-1820.

[13]Shin JY，Kim SY，Jeung MJ，Eun SH，Woo CW，Yoon SY，et al.Serum adiponectin，C-reactive protein and TNF-alpha levels in obese Korean children[J].J Pediatr Endocrinol Metab，2008，21(1):23-29.

[14]Kotronen A，Yki-J?rvinen H.Fatty liver:a novel component of the metabolic syndrome[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2008，28(1):27-38.

[15]Du YZ， Gu ZY， Li CL， Liu Y，Ma LC，Gong YP，et al.Exploration of effect of aging on insulin sensitivity of Wistar rats by using the euglycaemic-hyperinsulinaemic clamp[J].Chin J Geriatr Heart Brain Vessel Dis(中華老年心腦血管病雜志)，2009，11(5):369-372.

[16]Zhang M，Zhao D，Wang MY，Ren LM.Effect of urethane on insulin level in rats[J].Chin J Pharmacol Toxicol(中國藥理學與毒理學雜志)，2003，17(5):370-374.

[17]Cusin I，Rouru J，Rohner-Jeanrenaud F.Intracerebroventricular glucocorticoid infusion in normal rats:induction of parasympathetic-mediated obesity and insulin resistance[J].Obes Res，2001，9(7):401-406.

[18]Fang LH，Kim HI，Hu JJ，Wang YH，Du GH.Antidiabetic effect and mechanisms of gemfibrozil in experimental diabetes mellitus rats[J].Chin Pharm J(中國藥學雜志)，2009，44(6):426-431.

[19]Mulè G，Cottone S，Mongiovì R，Cusimano P，Mezzatesta G，Seddio G，et al.Influence of the metabolic syndrome on aortic stiffness in never treated hypertensive patients[J].Nutr Metab Cardiovasc Dis，2006，16(1):54-59.

[20]Tzou WS，Douglas PS，Srinivasan SR，Bond MG，Tang R，Chen W，et al.Increased subclinical atherosclerosis in young adults with metabolic syndrome:the Bogalusa Heart Study[J].J Am Coll Cardiol，2005，46(3):457-463.

[21]Scott M，Grundy MD.Executive Summary of the Third Report of the National Cholesterol Education Program(NCEP)Expert Panel on Detection，Evaluation，and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults[M].NIH Publication №.02-5215.2001，285:2486-2497.

[22]Saitoh M，Nishimura H，Tanaka T，Kondoh T.Genderrelated differences in target organ damage in untreated patients with essential hypertension[J].Intern Med，2006，45(6):377-383.