尿中腎損傷分子1水平升高對大鼠早期腎損傷的預測作用

申 俊，劉 妍，張金曉，高緒聰，周 飛，姜 凌，張建軍，張宗鵬

(1.天津中醫(yī)藥大學研究生部，天津 300193;2.天津市新藥安全評價研究中心毒理學研究室，天津 300193)

腎是體內最重要的排泄器官，也是外源性毒物在體內的主要代謝器官之一。很多化合物或藥物進入體內，通過某種或幾種機制對腎臟產生毒性作用。目前，傳統(tǒng)并常規(guī)用來檢測腎損傷的生物標志物是血清肌酐(serum creatinine，SCr)和血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)，但兩者只有在腎損傷達一定程度時才會明顯升高。SCr和BUN的這種不敏感性可能會使藥物順利通過臨床前安全性評價，而在臨床試驗階段或者上市后臨床應用階段導致患者腎損傷。因此，尋找早期、敏感和可量化的腎損傷生物標志物是新藥開發(fā)和臨床治療的迫切需求。

腎損傷分子1(kidney injury molecule-1，KIM-1)又被稱為T細胞免疫球蛋白和黏蛋白分子1或A型肝炎病毒細胞受體1，是一種Ⅰ型跨細胞膜糖蛋白，存在于CD4+T細胞和腎近曲小管上皮細胞內[1]。在正常腎組織中，KIM-1表達非常低，但是在不同的藥物或者環(huán)境毒物導致的腎功能損傷模型中，KIM-1會在去分化的腎臟近曲小管上皮細胞中高表達，并可以在尿中排出[2]。目前，KIM-1是研究較多的早期預測腎損傷的生物標志物[3－4]。2008年美國食品藥品監(jiān)督局和歐洲醫(yī)藥評價署宣布可將KIM-1用于藥物臨床前研究[5]，但仍需廣泛驗證。本研究制備順鉑、慶大霉素和環(huán)孢素誘導腎損傷大鼠模型，檢測尿 KIM-1、尿肌酐(urine creatinine，UCr)、SCr和BUN以及腎臟組織病理變化，評價尿KIM-1作為早期預測腎損傷敏感生物標志物的可能性，為其作為臨床前腎損傷的評價指標提供依據(jù)，并為臨床前新藥的安全性評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑和儀器

健康雄性SD大鼠，SPF級，體質量250～300 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號:SCXK(京)2006-0009，自由攝食和飲水，室溫20～26℃，濕度40%～70%，光照條件:12 h明/12 h暗。順鉑(cisplatin)和硫酸慶大霉素(gentamicin sulfate)，Sigma公司;環(huán)孢素(ciclosporine)軟膠囊，諾華制藥公司;大鼠KIM-1 ELISA試劑盒，美國R＆D公司;SCr，BUN和UCr檢測試劑，北京中生北控生物技術科技股份有限公司。Sunrise酶標儀，奧地利TECAN公司;Olympus BX51普通光學顯微鏡，日本Olympus公司;Canon power shat S45病理顯微攝影，日本Canon公司;7080全自動生化分析儀，日立公司。

1.2 順鉑腎損傷模型的制備[6]和標本采集

大鼠48只，經適應性飼養(yǎng)4 d后，隨機分為8組(每個時間點對應1個正常對照組和1個順鉑腎損傷模型組，共4個時間點)，每組6只，正常對照組ip給予生理鹽水，模型組 ip給予順鉑7.5 mg·kg－1，給藥1次，給藥體積為5 ml·kg－1。于單次給藥后第2，4，5和6天置于代謝籠內收集24 h尿液，隔日ip給予苯妥英鈉麻醉取全血。

1.3 慶大霉素腎損傷模型的制備[1，6]及標本采集

大鼠48只，經適應性飼養(yǎng)18 d后，隨機分為8組(每個時間點對應1個正常對照組和1個慶大霉素腎損傷模型組，共4個時間點)，每組6只，正常對照組ip給予生理鹽水，模型組ip給予慶大霉素120 mg·kg－1，每天給藥 1 次，連續(xù)給藥12 d，給藥體積為5 ml·kg－1。于首次給藥后第 2，6，9 和 12 天置于代謝籠內收集24 h尿液，隔日ip給予苯妥英鈉麻醉后取全血。

1.4 環(huán)孢素腎損傷模型的制備[6－7]及標本采集

大鼠48只，經適應性飼養(yǎng)5 d后，隨機分為8組(每個時間點對應1個正常對照組和1個環(huán)孢素腎損傷模型組，共4個時間點)，低鹽飲食，第1～22天ig給予環(huán)孢素(取適當?shù)拈蠙煊腿芙猸h(huán)孢素配制成所需濃度)3 mg·kg－1，給藥體積為 10 ml·kg－1;第23～43天改為sc給予環(huán)孢素 7 mg·kg－1;第44～52天 sc 給 予 環(huán) 孢 素 12 mg·kg－1，給 藥 體 積 為2.5 ml·kg－1，正常對照組 ig 給予橄欖油。于首次給藥后第7，14，35和52天置于代謝籠內收集24 h尿液，隔日ip給予苯妥英鈉麻醉后取全血。

1.5 SCr，BUN，UCr和尿 KIM-1的檢測

大鼠尿液和血標本，于1500×g離心10 min，分別取上清用于UCr、尿KIM-1、SCr和BUN的檢測。SCr，BUN和UCr使用自動生化儀進行檢測;尿液KIM-1使用KIM-1 ELISA試劑盒檢測，操作步驟按試劑盒說明書進行，經酶標儀檢測并讀取450 nm波長的吸光度(absorbance，A)值，以 A450nm值為縱坐標，標準品濃度為橫坐標繪制曲線，根據(jù)樣品的A450nm查找其濃度范圍。尿KIM-1含量用尿KIM-1/UCr比值(mg·mol－1)表示，即每排出 1 mol肌酐排出 KIM-1 的毫克數(shù)[8]。

1.6 大鼠腎組織病理學觀察

順鉑組大鼠于單次給藥后第3，5，6和7天;慶大霉素組大鼠于首次給藥后第3，7，10和13天;環(huán)孢素組大鼠于首次給藥后第8，15，36和53天處死大鼠，摘取腎，10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片和HE染色，于普通光學顯微鏡下觀察腎組織病理變化。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 順鉑對大鼠SCr，BUN和尿KIM-1水平的影響

表1結果顯示，與正常對照組比較，于單次給順鉑后第3，5和6天，SCr，BUN和尿KIM-1均明顯升高(P＜0.05);第7 天，BUN 明顯升高(P＜0.05)，SCr和尿KIM-1由于標準差較大，雖有升高趨勢但無統(tǒng)計學差異。尿KIM-1隨藥后時間延長，其升高幅度大于SCr和BUN，4個時間點分別升高為正常對照組的5.7，11.0，9.7 和17.5 倍;SCr為正常對照組的1.3，2.9，4.3 和 2.2 倍;BUN 為正常對照組的 1.7，4.0，6.1 和 4.0 倍。由圖 1 顯示，SCr，BUN和尿KIM-1給藥后不同時間點ROC的曲線下面積(area under curve，AUC)分別為 0.934，0.953 和0.979。可以看出，尿KIM-1與SCr和BUN相比在順鉑所致腎損傷模型中具有較好的靈敏度和特異性。

2.2 慶大霉素對大鼠SCr，BUN和尿KIM-1水平的影響

首次給藥后第7天，SCr和BUN未見明顯升高，尿KIM-1有升高趨勢;第10和13天，模型組分別僅1只和2只大鼠SCr和BUN與正常對照組相比明顯升高，而尿KIM-1均較正常對照組明顯升高(P＜0.05);且尿KIM-1隨給藥時間的延長，與SCr和BUN比較升高幅度更為明顯，3個時間點升高倍數(shù)分別為正常對照組的2.6，13.5和34.9倍;SCr為正常對照組的 1.1，1.7 和 1.6 倍，BUN 為正常對照組的1.0，2.0和1.9 倍(表2)。由圖2 顯示，SCr，BUN和尿KIM-1給藥后不同時間點ROC曲線的 AUC 分別為0.877，0.713和 0.932。可以看出尿KIM-1與SCr和BUN比較在慶大霉素所致腎損傷大鼠模型中具有更好的靈敏度和特異性。

Tab.1 Changes of serum creatinine(SCr)，blood urea nitrogen(BUN)and urinary kidney injury molecule-1(KIM-1)levels in rats with kidney injuries induced by cisplatin

Fig.1 Receiver operating characteristic(ROC)curve for SCr，BUN and urinary KIM-1 at different times after ip given cisplatin 7.5 mg·kg －1.See Tab.1 for rat treatments.AUC:area under curve.

Tab.2 Changes of SCr，BUN and KIM-1 levels of rats with kidney injuries induced by gentamicin(Gen)

Fig.2 ROC curve for SCr，BUN and urinary KIM-1 at different times injected with 120 mg·kg－1gentamicin for 12 d.See Tab.2 for rat treatments.

2.3 環(huán)孢素對大鼠SCr，BUN和尿KIM-1水平的影響

由表3看出，首次給藥后第8天，SCr和BUN水平均未見明顯改變，尿KIM-1明顯高于正常對照組(P＜0.05);第15和36天，BUN和尿KIM-1顯著高于正常對照組，SCr未見明顯改變;第53天，SCr，BUN和尿KIM-1均明顯升高(P＜0.01)。尿KIM-1隨給藥時間延長，比SCr和BUN升高幅度更為明顯，4個時間點升高倍數(shù)分別為正常對照組的 1.6，2.7，5.3和10.3倍，SCr分別為正常對照組的 1.1，1.0，1.0 和1.2 倍，BUN 分別為正常對照組的0.8，1.4，1.6 和2.2倍。由圖3所示，SCr，BUN和尿KIM-1給藥后不同時間點ROC曲線的AUC分別為0.668，0.766和0.976。可見尿KIM-1與SCr和BUN相比具有更好的靈敏度和特異性。

Tab.3 Changes of SCr，BUN and KIM-1 levels of rats with kidney injuries induced by ciclosporine(Cyc)

Fig.3 ROC curve for SCr，BUN and urine KIM-1 at different times after administrated with ciclosporine for 52 d.See Tab.3 for rat treatments.

2.4 順鉑對大鼠腎組織病理變化的影響

圖4 顯示，正常對照組大鼠腎組織無明顯病理改變(圖4A)，模型組單次給藥后第5天(圖4B)，第6天(圖4C)和第7天(圖4D)腎組織均出現(xiàn)程度不等的皮髓交界處部分腎小管擴張，腎小管上皮細胞變性、壞死脫落，基底膜裸露，腔內有大量紅染無結構的顆粒狀物質，較多腎小管腔內有蛋白管型。

2.5 慶大霉素對大鼠腎組織病理變化的影響

圖5顯示，正常對照組大鼠腎組織無明顯病理改變(圖5A);而模型組首次給藥后第10天(圖5B)和第13天(圖5C)，腎臟組織可見腎小管擴張、變性、壞死和蛋白管型等病理改變。

2.6 環(huán)孢素對大鼠腎組織病理變化的影響

圖6顯示，正常對照組大鼠腎組織無明顯病理改變(圖6A);而模型組首次給藥后第53天所有大鼠腎組織可見較多腎小管變性，胞漿疏松淡染，嚴重者出現(xiàn)空泡樣，較多腎小管嗜堿性變，胞漿淡染，胞核增大嗜堿性增強。

Fig.4 Effect of cisplatin on histopathological changes of kidneys in rats(HE ×400).See Tab 1 for rat treatments.A:normal control group;B:model group，on the 5th day after cisplatin was once ip treated(Arrow shows:tubular degeneration and necrosis);C:model group，on the 6th day after cisplatin was once ip treated(Arrow shows:protein casts);D:model group，on the 7th day after cisplatin was once ip treated(Arrow shows:tubular regeneration and dilatation).

Fig.5 Effect of gentamicin on histopathological changes of kidneys in rats(HE ×400).See Tab 2 for rat treatments.A:normal control group;B:model group，on the tenth days after gentamicin was first ip treated(Arrow shows:tubular degeneration and necrosis);C:model group，on the thirteenth days after gentamicin was first ip treated(Arrow shows:protein casts).

Fig.6 Effect of ciclosporine on histopathological changes of kidneys in rats(HE ×400).See Tab 3 for rat treatments.A:normal control group;B:model group，on the 53rd day after ciclosporine was first ip treated(Arrow shows:tubular degeneration);C:model group，on the 53rd day after ciclosporine was first ip treated(Arrow shows:tubular regeneration).

3 討論

SCr和BUN是反映腎損傷最主要的生物標志物[9－10]，是臨床前安全性評價中常規(guī)的檢測指標[6]，但有下列局限:① SCr易受年齡、性別、種族、飲食和機體內環(huán)境等因素影響;②SCr常于腎組織學改變達50%以上時升高，無法預測早期病變;③SCr血液蓄積只與腎小球濾過率降低相關，不能反映腎小管損傷和壞死;④ BUN不僅受腎功能的影響，還受腎外因素的影響，如高蛋白飲食、消化道出血及高分解代謝等。因此，SCr和BUN在檢測腎功能方面顯示出明顯的不準確性和滯后性。

KIM-1是腎臟近曲小管上皮細胞表達的一種跨膜蛋白，在正常腎組織中表達水平極低，但在腎損傷因素的作用下，可特征性升高，表達于腎損傷的腎小管上皮細胞頂膜并持續(xù)到細胞損傷完全修復。KIM-1的胞外功能區(qū)受金屬基質蛋白酶的調節(jié)，可裂解并釋放入尿。KIM-1的上述特性，使它可能成為一種檢測腎損傷的理想生物標志物。尿中KIM-1水平采用UCr加以校正，可以校正因尿量變化對KIM-1含量的影響。

順鉑的腎毒性機制包括引起腎血管收縮，使腎血流量及腎小球濾過率下降，從而引起蛋白尿和腎功能損傷等癥狀;引起近端腎小管上皮細胞缺血、缺氧甚至壞死[3]。慶大霉素的腎毒性機制有溶酶體損傷學說和線粒體損傷學說等，主要表現(xiàn)為近端腎小管S1段和S2段的上皮細胞變性壞死，壞死多成局灶性，壞死灶周圍可有炎癥細胞浸潤[4]。環(huán)孢素是一種強效的免疫抑制劑，腎毒性是其嚴重的不良反應之一，主要通過前列腺素代謝失衡和腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活等導致腎細胞、組織和器官的損傷[6]。

在本實驗順鉑所致的腎損傷模型中，于單次給藥后第3天，病理顯示除部分大鼠腎小管腔內有蛋白管型外，未見其他明顯病變，此時SCr和BUN水平略有升高，而KIM-1明顯升高，表明在腎組織發(fā)生輕微病變時，KIM-1較SCr和BUN相比即表現(xiàn)出明顯的升高;第5天，腎組織皮髓交界處開始出現(xiàn)部分腎小管擴張，腎小管上皮細胞變性、壞死脫落，基底膜裸露，并隨藥后時間延長，損傷程度加重，SCr和BUN隨病變的加重表現(xiàn)為先高后低的趨勢，而KIM-1隨藥后時間延長，持續(xù)大幅度升高，與腎損傷程度呈一致性。慶大霉素所致的腎損傷模型中，在第10天，腎組織出現(xiàn)明顯病變，表現(xiàn)為部分大鼠腎小管變性、壞死、蛋白管型和腎小管擴張，間質較多炎癥細胞浸潤等，此時SCr和BUN也開始明顯升高，而KIM-1在給藥后第7天，已經開始有升高趨勢;隨著給藥時間的延長，腎組織病變加重，KIM-1持續(xù)明顯升高，至第13天時，升高到正常對照組的34.9倍，而SCr和BUN升高水平與第10天時持平。環(huán)孢素所致的腎損傷模型中，于首次給藥后第53天，腎組織出現(xiàn)明顯的病理改變，表現(xiàn)為腎小管變性，胞漿疏松淡染，嚴重者出現(xiàn)空泡樣，較多腎小管嗜堿性變;SCr和BUN分別于第15天和第53天出現(xiàn)升高，而KIM-1在第8天時開始明顯升高，早于SCr和BUN升高及病理改變，并隨給藥時間延長持續(xù)明顯升高。根據(jù)上述結果可以認為，在不同藥物造成的腎損傷中，尿KIM-1在未出現(xiàn)或僅出現(xiàn)輕微病理改變時即明顯升高，與腎損傷程度表現(xiàn)出良好的正向相關性。與SCr和BUN相比，尿KIM-1升高更早且升高幅度更為明顯。

本研究采用ROC曲線下AUC分析SCr，BUN和尿KIM-1的靈敏度和特異性，顯示3個藥物模型組尿KIM-1的AUC值均最高，在0.9以上，表明尿KIM-1在靈敏度和特異性方面優(yōu)于SCr和BUN。

綜上所述，KIM-1相比于傳統(tǒng)的生物標志物SCr和BUN，在評估藥物誘導的腎毒性中，不僅具有更好的靈敏度和特異性，而且能夠對腎損傷進行早期預測，并有助于確定腎損傷部位。在新藥的臨床前開發(fā)階段，可更準確地預測候選藥物的腎毒性，有利于早期鑒別、盡快淘汰有潛在腎毒性的化合物，減少新藥開發(fā)中不必要的時間和成本的耗費。

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