白藜蘆醇對(duì)肝脂肪積累的抑制作用及其分子機(jī)制

李燕強(qiáng) 華偉娜 楊俊霞 潘志強(qiáng)

1.徐州醫(yī)學(xué)院江蘇省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室江蘇省麻醉與鎮(zhèn)痛應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州 221000；2.廣東省羅定市廷鍇紀(jì)念中學(xué)，廣東羅定 527200

白藜蘆醇對(duì)肝脂肪積累的抑制作用及其分子機(jī)制

李燕強(qiáng)1華偉娜2楊俊霞1潘志強(qiáng)1

1.徐州醫(yī)學(xué)院江蘇省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室江蘇省麻醉與鎮(zhèn)痛應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州 221000；2.廣東省羅定市廷鍇紀(jì)念中學(xué)，廣東羅定 527200

目的研究白藜蘆醇對(duì)SIRT基因家族表達(dá)的影響，探討白藜蘆醇抑制不同條件引起脂肪積累的分子機(jī)制。方法分別用高糖、高糖+白藜蘆醇、高脂、高脂+白藜蘆醇的培養(yǎng)基處理肝細(xì)胞HL7702，油紅O染色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂肪積累水平；后提取各組蛋白質(zhì)，Western blotting方法檢測(cè)不同組間SIRT基因家族各成員的表達(dá)情況。結(jié)果白藜蘆醇能明顯降低高脂引起的脂肪積累，對(duì)高糖引起的脂肪積累作用不明顯；在高脂條件下，白藜蘆醇可以促使SIRT1、SIRT3、SIRT4和SIRT5的表達(dá)增加，使SIRT7表達(dá)降低；在高糖條件下，白藜蘆醇可以促使SIRT1、SIRT4、SIRT5和SIRT7的表達(dá)增加。結(jié)論SIRT1、SIRT3和SIRT7是白藜蘆醇抑制脂肪積累的關(guān)鍵基因。

白藜蘆醇；肝脂肪積累；抑制作用；分子機(jī)制

白藜蘆醇是一種多酚類植物化合物，是普遍存在于葡萄酒中的活性成分，近期研究表明白藜蘆醇具有抵抗肥胖、抗高血糖和高血脂等作用，對(duì)能量代謝疾病有潛質(zhì)的治療作用[1]。白藜蘆醇在哺乳動(dòng)物中主要通過(guò)激活組蛋白脫乙酰基酶沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）發(fā)揮作用[2]。

SIRT家族共有7個(gè)成員，其活性都依賴于細(xì)胞內(nèi)NAD+ /NADH的比例，提示SIRT家族可能參與能量代謝的調(diào)控[3]。已有研究表明，白藜蘆醇通過(guò)激活SIRT1，進(jìn)而抑制脂肪酸合成、增加脂肪降解，并能促進(jìn)糖異生抑制糖酵解作用[3]。然而，白藜蘆醇對(duì)SIRT家族其他成員的調(diào)控作用尚未見報(bào)道。本文采用高糖和高脂肝細(xì)胞模型，檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)兩種細(xì)胞模型脂肪積累的影響，并檢測(cè)在兩種細(xì)胞模型中白藜蘆醇對(duì)SIRT家族成員表達(dá)量的影響，進(jìn)一步探討白藜蘆醇抑制不同條件引起的脂肪積累的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑

本研究采用的正常人肝細(xì)胞HL7702購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。

白藜蘆醇購(gòu)自Sigma；SIRT家族成員抗體以及HPR二抗均購(gòu)自Santa Cruz；Protein Detector LumiGLOWestern Blot Kit購(gòu)自KPL公司；油紅O購(gòu)自Sigma公司；PVDF膜購(gòu)自Roche。

1.2 細(xì)胞處理

細(xì)胞根據(jù)處理方式不同分成以下四組：HP組（高脂處理，培養(yǎng)基含有200μmol/L軟脂酸）、HPR組（高脂+白藜蘆醇組，培養(yǎng)基含有200μmol/L軟脂酸鈉和50μmol/L白藜蘆醇）、HG組（高糖處理，培養(yǎng)基含4 500mg/L葡萄糖）和HGR組（高糖+白藜蘆醇組，培養(yǎng)基含4 500mg/L葡萄糖和50μmol/L白藜蘆醇）；各組細(xì)胞處理24 h后收獲，進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。

1.3 油紅O染色

細(xì)胞采用4%多聚甲醛固定4min，PBS清洗，后加入稀釋過(guò)的油紅O溶液，搖床染色20 min，自來(lái)水沖洗，然后進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：蘇木素復(fù)染10 s，1%鹽酸酒精分化，拍照；或采用異丙醇溶解溶液，收獲溶解液，在510 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光值。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.4 總蛋白提取

預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，按照細(xì)胞數(shù)1.0×106/20μL裂解液的比例，加入預(yù)冷的單去污裂解液[50mmol/LTris（pH 8.0），150mmol/L NaCl，1%NP-40]，同時(shí)按一定比例加入蛋白酶抑制劑，冰上裂解30min，4℃下12 000 r/min離心5min，吸取上清，紫外分光光度計(jì)定量檢測(cè)蛋白濃度后-70℃分裝保存。

1.5 W estern blotting

每條泳道加入等量的蛋白樣本（50～100μg），加入5×蛋白上樣緩沖液[1 mmol/L Tris-HCl（pH 6.8），5%beta-巰基乙醇，2%SDS，0.01%溴酚藍(lán)，10%甘油]。100℃變性5 min，后10%～12%SDS-PAGE電泳分離，后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，Protein Detector LumiGLOWestern Blot Kit檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對(duì)HL7702細(xì)胞脂肪積累的影響

圖1結(jié)果顯示，在高脂組，白藜蘆醇處理HL7702細(xì)胞后，脂肪積累量顯著下降（P＜0.05）；在高糖組，白藜蘆醇處理后，細(xì)胞脂肪積累量變化不明顯，說(shuō)明在肝細(xì)胞中，白藜蘆醇能有效抑制由高脂引起的脂肪積累，對(duì)高糖引起的脂肪積累抑制效果并不明顯。

2.2 白藜蘆醇對(duì)SIRT家族表達(dá)量的影響

為進(jìn)一步探討白藜蘆醇對(duì)不同條件引起的脂肪積累的作用機(jī)制，筆者檢測(cè)了高脂處理組和高糖處理組中SIRT家族的表達(dá)量變化。Western Blotting結(jié)果顯示，與HP組比較，HP+R組HL7720細(xì)胞中的SIRT1，SIRT3，SIRT4和SIRT5的表達(dá)增加，SIRT7表達(dá)降低（P＜0.05）（圖2）；與HG組比較，高糖+白藜蘆醇處理可以促使SIRT1，SIRT4，SIRT5和SIRT7的表達(dá)增加（P＜0.05）（圖3）。以上結(jié)果提示，在不同條件引起的脂肪積累中，白藜蘆醇的作用機(jī)制是截然不同的。

3 討論

白藜蘆醇是一種多酚化合物，在葡萄皮和葡萄籽中含量豐富。白藜蘆醇具有減輕高熱量飲食帶來(lái)的不良影響、抵抗肥胖和延長(zhǎng)壽命等作用[4]，因此，從分子水平上了解白藜蘆醇的作用機(jī)制，為其作為預(yù)防和治療能量代謝疾病、保持健康和延長(zhǎng)壽命的關(guān)鍵調(diào)控因子提供重要的理論依據(jù)。本結(jié)果顯示，在正常肝細(xì)胞中，白藜蘆醇對(duì)于高脂引起的脂肪積累有顯著的抑制作用，然而對(duì)高糖引起的脂肪積累作用并不明顯，提示白藜蘆醇對(duì)不同條件導(dǎo)致的脂肪積累的機(jī)制可能是截然不同的。目前研究表明，白藜蘆醇能特異性激活SIRT1，進(jìn)而調(diào)控下游p53、NF-κB、FoxO、PGC-1α、PPAR、C/EBPa和C/EBPd等重要信號(hào)通路關(guān)鍵分子[2，5-8]，發(fā)揮其生理學(xué)和生物學(xué)功能，然而，由白藜蘆醇引起的SIRT1激活涉及哪些相互蛋白的相應(yīng)活化，白藜蘆醇對(duì)SIRT家族其他成員是否存在調(diào)控作用，SIRT成員之間是否存在聯(lián)系等問(wèn)題尚不清楚。本結(jié)果顯示，在高脂和高糖處理的細(xì)胞模型中，白藜蘆醇除了可以激活SIRT1蛋白的表達(dá)，還能使SIRT4和SIRT5的表達(dá)增加。已有研究表明，SIRT1具有核穿梭功能，主要定位與細(xì)胞漿和細(xì)胞核[9]，而SIRT4和SIRT5則主要定位于線粒體[10-11]，定位的不同提示其發(fā)揮的功能截然不同，具有核穿梭能力的SIRT1更多發(fā)揮的是信號(hào)傳導(dǎo)分子的作用，定位于線粒體的SIRT4和SIRT5則主要參與呼吸作用的能量傳遞，但由于他們對(duì)于NAD（+）的依賴性[12]，使他們不可避免存在功能相關(guān)性，例如它們都參與能量代謝的調(diào)控，因此它們對(duì)白藜蘆醇的刺激均表現(xiàn)活性的變化，正是其功能相關(guān)性的重要體現(xiàn)。

為了進(jìn)一步探討白藜蘆醇的分子作用機(jī)制，需更關(guān)注在高脂和高糖處理的肝細(xì)胞模型中，表達(dá)趨勢(shì)不一致的SIRT家族成員。在高脂處理的細(xì)胞模型中，SIRT3表達(dá)量增加，SIRT7表達(dá)量下降，而在高糖處理的細(xì)胞模型中，SIRT3表達(dá)量沒有明顯變化，SIRT7表達(dá)量升高，這些結(jié)果提示，SIRT3和SIRT7可能是白藜蘆醇在高脂和高糖引起的脂肪積累中影響作用不一致的關(guān)鍵因素。已有研究表明，SIRT1和SIRT3均對(duì)AceCS1具有高親和性，并且SIRT3對(duì)AceCS2的乙酰化修飾起調(diào)控作用[13]，這些結(jié)果提示SIRT1和SIRT3在能量代謝中發(fā)揮協(xié)同作用，共同調(diào)控能量代謝的關(guān)鍵分子acetyl-CoA的合成。目前研究表明，SIRT7主要定位于細(xì)胞核，參與rDNA的轉(zhuǎn)錄，是PolⅠ轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控因子，而SIRT1通過(guò)去乙酰化作用于TAFI68負(fù)調(diào)控PolⅠ[14-15]，這些結(jié)果表明，SIRT1和SIRT7作用相反，是一對(duì)拮抗分子。因此，在高脂處理的細(xì)胞模型中，由于與SIRT1發(fā)揮協(xié)同作用的SIRT3表達(dá)增加而與SIRT1發(fā)揮拮抗作用的SIRT7下調(diào)表達(dá)，放大了SIRT1的作用，因此脂肪積累受到抑制；在高糖處理的細(xì)胞模型中，SIRT7表達(dá)增高而SIRT3表達(dá)不變，SIRT1的作用被抵消，因此白藜蘆醇脂肪積累效果不明顯。

綜上所述，白藜蘆醇發(fā)揮功能的關(guān)鍵在于SIRT1及其協(xié)同/拮抗作用因子的作用總和，如何通過(guò)增強(qiáng)協(xié)同因子、減少拮抗因子的作用進(jìn)而放大SIRT1的功能，對(duì)于白藜蘆醇發(fā)揮脂肪積累作用至關(guān)重要，這為白藜蘆醇的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

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Effect and mechanism of resveratrol on inhibition of fat accumulation in liver cells

LIYanqiang1 HUAWeina2 YANG Junxia1 PAN Zhiqiang1
1.Anesthesiology Key Laboratory of Xuzhou Medical College in Jiangsu Province Anesthesia and Analgesia Application Technology Key Laboratory in Jiangsu Province,Jiangsu Province,Xuzhou 221000,China;2.General Cai TingkaiMemorial Middle School in Luoding City,Guangdong Province,Luoding 527200,China

ObjectiveTo investigate the effect of resveratrol on SIRT family and the differentmechanism of inhibited effect of resveratrol on fat accumulation in liver cells causing by different conditions.MethodsLiver cells were treated by high palmitate,high palmitate+resveratrol,high glucose or high glucose+resveratrol respectively.Then the level of fat accumulation wasmeasured by Oil red O staining.The SIRT family protein level was detected by Western blotting.ResultsResveratrol could significantly decrease fat accumulation caused by high palmitate,but not by high glucose.Resveratrol could increase the expression of SIRT1,SIRT3,SIRT4,SIRT5,but decrease SIRT7 in high palmitate condition,while it could increase SIRT1,SIRT4,SIRT5 and SIRT7 expression in high glucose condition.ConclusionSIRT1,SIRT3 and SIRT7 play important roles of inhibiting fat accumulation inducing by resveratrol.

Resveratrol;Fat accumulation in liver cells;Inhibition;Mechanism

R735.7

A

1673-7210（2012）11（c）-0009-03

李燕強(qiáng)（1978.8-），男，廣東從化人，博士研究生，助理研究員；研究方向：生物醫(yī)學(xué)工程。

潘志強(qiáng)（1974.7-），男，安徽淮北人，博士研究生，副研究員；研究方向：藥物的腦保護(hù)作用及機(jī)制。

2012-05-24 本文編輯：衛(wèi)軻）