樹突狀細胞DNA多價疫苗抗日本血吸蟲感染作用機制的研究＊

血吸蟲病是一種流行廣泛、嚴重危害人體健康并影響畜牧業生產的人獸共患寄生蟲病。作為吡喹酮化療的補充，血吸蟲病疫苗的研究是一種更有效的控制措施。血吸蟲病疫苗的研究已有半個多世紀，歷經死疫苗、減弱活疫苗、基因工程疫苗和核酸疫苗四個階段。盡管血吸蟲病疫苗的研究工作已取得一定的進展，但離實際應用尚有一定的距離，增強DNA疫苗的免疫效果便成為當前血吸蟲病疫苗研究的焦點，有必要進一步加強對血吸蟲的生物學特性、血吸蟲與宿主的相互關系以及混合抗原、細胞免疫、疫苗免疫方法、免疫途徑、佐劑應用等基礎方面的研究［1］。

樹突狀細胞（DC）是體內功能最強的一種專職抗原提呈細胞，在機體免疫應答中起著核心作用。由于其獨特的功能，DC目前廣泛應用于抗感染、腫瘤、自身免疫病和移植免疫等［2－3］。作者此前已成功地將Sj26、Sj23和Sj14基因分別轉染至小鼠DC，并在DC中得到穩定表達，聯合免疫具有明顯的協同或增強作用，本研究在此基礎上對其保護性免疫機制進行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料 DC細胞株MTSC4（北京醫科大學免疫學系陳慰峰教授惠贈），常規方法培養傳代；BALB/c小鼠，6～8周齡、雌性（武漢市生物制品研究所）；小鼠白細胞介素－4（IL－4）和干擾素－γ（IFN－γ）檢測試劑盒（英國BD Biosciences Pharmingen公司）；噻唑藍MTT（美國Invitrogen公司）；二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司）；HRP標記羊抗鼠IgG（美國Bio－Rad公司）；RPMI－1640培養液（美國Gibco公司）；胎牛血清（FCS，杭州四季青公司）。

1.2 方法

1.2.1Sj26基因轉染 DC、Sj23基因轉染 DC、Sj14基因轉染DC、pcDNA3轉染DC的制備與培養 參照文獻［4］制備，按常規方法培養傳代。

1.2.2 動物免疫 BALB/c小鼠隨機分為7組，每組12只。A組為Sj26、Sj23、Sj14基因轉染DC，B組為Sj26基因轉染DC，C組為Sj23基因轉染DC，D組為Sj14基因轉染DC，E組為空質粒pcDNA3轉染DC，F組為未處理DC，G組為RPMI－1640對照組。免疫前用RPMI－1640培養液洗滌細胞2次，0.25%胰蛋白酶分別消化各組DC，調細胞濃度為1×106/mL。A－F組，每只小鼠分別經耳廓注射0.2 mL細胞懸液，G 組注射0.2mL RPMI－1640培養液。共免疫3次，間隔2w。末次免疫后第2w，每鼠經皮膚感染40條日本血吸蟲尾蚴。

1.2.3 血清特異性IgG抗體檢測 收集初次免疫前、末次免疫后第2w以及攻擊感染后第6周各組小鼠血清，ELISA法檢測特異性IgG抗體。可溶性蟲卵抗原（SEA）以10mg/mL包被酶標板，待測血清稀釋度為1∶100，HRP標記羊抗鼠IgG工作濃度為1∶1000，底物為鄰苯二胺，終止反應后用酶標儀測定吸光度（A491）值。

1.2.4 血清細胞因子IFN－γ和IL－4檢測 按照IFN－γ和IL－4檢測試劑盒操作說明書，ELISA法分別檢測初次免疫前和末次免疫后第2w小鼠血清細胞因子水平。待測血清稀釋度為1∶10，酶標儀測定吸光度（A450）值。根據同一酶標板上的標準曲線，計算待測樣品中相應的細胞因子水平。

1.2.5 IFN－γ和IL－4的誘生及檢測 攻擊感染后第6w，無菌取小鼠脾臟，常規法制備脾淋巴細胞懸液。以含10%胎牛血清的RPMI－1640培養液調細胞濃度為5×106/mL，加至24孔細胞培養板中，1 mL/孔，每份樣本設3孔，分別加入RPMI－1640培養液、SEA（10μg/mL）和 ConA（5μg/mL），37℃、5%CO2培養箱中孵育72h，14 000×g離心10min，收集上清液。雙夾心ELISA法檢測小鼠脾淋巴細胞誘生的IFN－γ和IL－4水平。

1.2.6 脾淋巴細胞增殖試驗 將脾淋巴細胞加至96孔細胞培養板中，細胞數為2×105，200μL/孔，分別加入SEA（10μg/mL）和ConA（5μg/mL），同時設立 RPMI－1640培養液陰性對照，37℃、5%CO2培養箱中孵育72h，終止培養前，每孔加入MTT 10μL，混勻后繼續培養6h。吸去上清，加入DMSO 100μL/孔，振蕩以充分溶解甲肷產物，酶標儀測定吸光度（A560）值。按公式計算刺激指數（SI），SI＝刺激孔A560均值/對照孔A560均值。

1.2.7 統計分析 用SAS軟件包對數據進行ANOVA檢驗和t檢驗。

2 結 果

2.1 血清特異性IgG抗體水平 末次免疫后第2 w，A－D組小鼠血清特異性IgG抗體水平較免疫前顯著升高，且明顯高于E和F組（P＜0.05）。感染后第6w，各組小鼠血清抗體水平差異無統計學意義（表1）。

2.2 血清IFN－γ水平 免疫后，A－D組小鼠IFN－γ水平較免疫前明顯增高（P＜0.01），且明顯高于E和F組（P＜0.01）（表2）。

表2 各組小鼠血清IFN－γ水平的比較Tab.2 Comparison of IFN－γlevels in sera from each group of mice

2.3 血清IL－4水平 免疫前、后各組小鼠血清IL－4水平差異無統計學意義（表3）。

2.4 脾淋巴細胞IFN－γ的誘生 A－D組小鼠脾淋巴細胞經ConA和SEA刺激誘生的IFN－γ水平顯著高于G組（P＜0.001），E和F組在ConA和SEA刺激下產生的IFN－γ水平與G組相比，差異均無統計學意義（表4）。

2.5 脾淋巴細胞IL－4的誘生 A－D組小鼠脾淋巴細胞經ConA和SEA刺激誘生的IL－4水平明顯低于G組（P＜0.001），E和F組在ConA和SEA刺激下產生的IL－4水平與G組相比，差異均無統計學意義（表5）。

2.6 脾淋巴細胞刺激指數 小鼠脾淋巴細胞經ConA和SEA刺激后的刺激指數，A－D組明顯高于G組（P＜0.001），E和F組的刺激指數與G組相比，差異均無統計學意義（表6）。

表3 各組小鼠血清IL－4水平的比較Tab.3 Comparison of IL－4levels in sera from each group of mice

表4 各組小鼠脾淋巴細胞IFN－γ的誘生Tab.4 IFN－γresponses of spleen lymphocytes from each group of mice

表5 各組小鼠脾淋巴細胞IL－4的誘生Tab.5 IL－4responses of spleen lymphocytes from each group of mice

表6 各組小鼠脾淋巴細胞刺激指數Tab.6 Stimulating index of spleen lymphocytes from each group of mice

3 討 論

日本血吸蟲病疫苗候選抗原可分為7大類，酶性抗原（谷胱甘肽S轉移酶、磷酸丙糖異構酶）、肌球蛋白抗原（副肌球蛋白）、膜相關蛋白（Sj23）、鈣相關蛋白（脂肪酸結合蛋白、鈣蛋白酶、鈣網蛋白）、線粒體相關蛋白、性別相關蛋白、信號蛋白（Sj14－3－3）等［5］。迄今為止，單價抗感染疫苗候選分子誘導的保護力很少超過50%，究其因，一是由于血吸蟲感染后保護性免疫機制復雜多樣，包括體液免疫和細胞免疫，并有其它細胞和補體等的參與，不同的抗原分子誘導的保護性免疫機制不同，而不同蟲期的保護性抗原的特異性亦不同，人們對于血吸蟲感染后的免疫機制目前尚不完全清楚；其二是血吸蟲是一種多細胞生物，且生活史復雜，抗原成分多樣，由于血吸蟲與宿主在長期共進化過程中，產生了多種免疫逃避機制，使得疫苗的研制未能獲得理想效果；其三是由于DNA疫苗免疫原性較弱，對CD＋8T細胞和CD＋4T細胞的刺激作用均較弱［6］。

多價DNA疫苗可增加有效的抗原決定簇數量，模擬血吸蟲自然感染，能刺激機體產生更多的保護性抗體和激活更多效應T細胞，獲得較好的免疫效果。DC是體內功能最強的抗原提呈細胞，在刺激免疫反應中起著核心作用，能刺激T淋巴細胞，尤其是初始T細胞。盡管DNA疫苗僅能直接轉染較小一部分的DC，但是實驗研究發現在引流淋巴結中的所有DC均能被廣泛激活，從而為效應T細胞的活化提供了最佳條件，DNA疫苗若能以DC為載體可望獲得良好的免疫效果［7］。因此，尋找新的疫苗候選分子、聯合一種或幾種有效抗原分子制成混合多價疫苗、結合佐劑的應用等提高疫苗分子的免疫效果的研究，是當前血吸蟲病疫苗研究的主攻方向［8］。

研究證實，機體抗血吸蟲感染的保護性免疫與Th1型細胞介導的免疫應答有關，發展以Th1型優勢免疫應答為主的疫苗，將是高效血吸蟲病疫苗研制的關鍵。本研究結果表明體液免疫和細胞免疫共同參與了DC DNA混合多價疫苗誘導的保護性免疫作用，DC DNA混合多價疫苗誘導的抗日本血吸蟲感染的保護性免疫，與小鼠Th1型免疫應答的增強有關，為血吸蟲病疫苗的研究打下了基礎。

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