清開靈注射液對LPS誘導(dǎo)的兔彌散性血管內(nèi)凝血的作用*

孫 浩，王 珣，柳佳利，林 熙

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，廣東廣州510632)

彌散性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)是由不同病理原因引起的、無明確定位的全身性血管內(nèi)凝血系統(tǒng)激活和微血栓形成，臨床上以出血和血栓并存，以及多器官功能衰竭為特征的綜合征［1］。目前已證明DIC和炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，在危重的DIC患者中，炎癥反應(yīng)在其病理生理進展中發(fā)揮重要作用［2－3］。DIC具有起病急驟、發(fā)展迅速、預(yù)后極差、死亡率高的特點。目前臨床上對其主要采用抗凝治療，其代表類藥物為肝素。但應(yīng)用肝素治療時副作用明顯，?？杉又鼗颊叱鲅獌A向。

清開靈注射液為中成藥制劑，主要成分為膽酸、珍珠母、豬去氧膽酸、板蘭根、金銀花等。近年來有研究發(fā)現(xiàn)清開靈注射液能夠通過抑制全身炎癥介質(zhì)所介導(dǎo)的炎癥細胞黏附以及內(nèi)皮損傷，從而有效的減輕全身炎癥反應(yīng)［4］。以上提示清開靈注射液可能可以通過減輕全身炎癥反應(yīng)來起到抗DIC的作用。

DIC的治療主要針對高凝期，此期凝血系統(tǒng)被激活，凝血酶產(chǎn)生增多，血液中凝血酶含量增高，血液表現(xiàn)為高凝狀態(tài)，微循環(huán)中形成大量微血栓，易造成血管栓塞以及多器官功能衰竭［5］。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的DIC模型主要是模擬DIC的高凝期，本課題組擬通過注射LPS建立家兔DIC模型，觀察家兔凝血系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)以及血漿丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、血尿素氮(blood urine nitroge，BUN)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF－α)的變化，從而證實清開靈注射液對LPS誘導(dǎo)家兔DIC的拮抗作用。

材料和方法

1 動物

健康雄性新西蘭家兔60只，體重2．0～2．5 kg，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，粵檢證字［SCXK(粵)2008－0002］。

2 試劑及儀器設(shè)備

清開靈注射液購于北京中醫(yī)藥大學(xué)藥廠，批號611013A;LPS購于Sigma;肝素購于中國醫(yī)藥工業(yè)有限公司;蛋白C和抗凝血酶Ⅲ(antithormbinⅢ，ATⅢ)活性檢測試劑盒購于上海太陽生物技術(shù)公司;ELISA試劑盒(tumor necrosis factorα，TNF－α)購于BD Biosciences。Sysmex CA1500+CA6000全自動凝血分析儀(KOBE);Sysmex SE－9500全自動血細胞分析儀(KOBE);HITACHI 7170全自動血漿分析儀(HITACHI)。

3 主要方法

3．1 動物模型的建立 參照Hermida等［6］方法，用LPS誘導(dǎo)家兔DIC。3%戊巴比妥鈉按30 mg/kg從家兔耳緣靜脈注射麻醉，分離右側(cè)頸動脈、插管，以備取血。LPS溶于60 mL生理鹽水中，然后以100 μg·kg－1·h－1(10 mL/h)的速度從家兔耳緣靜脈滴注，連續(xù)6 h給藥，建立穩(wěn)定的家兔DIC模型。給藥后2 h、4 h給予戊巴比妥鈉腹腔注射，維持動物的持續(xù)麻醉狀態(tài)。

3．2 動物分組 將家兔隨機分6組，每組10只(1)正常對照組:(2)DIC模型組:(3)低劑量清開靈注射液治療組;(4)中劑量清開靈注射液治療組;(5)高劑量清開靈注射液治療組;(6)肝素對照組。

3．3 給藥方法 (1)正常對照組:從家兔雙側(cè)耳緣靜脈以10 mL/h的速度滴注生理鹽水(既不注射LPS，也不注射清開靈注射液和肝素，連續(xù)6 h)。(2)DIC模型組:從家兔一側(cè)耳緣靜脈以100μg·kg－1·h－1(10 mL/h)的速度滴注 LPS，同時從對側(cè)耳緣靜脈以10 mL/h的速度滴注生理鹽水，連續(xù)6 h。(3)低劑量清開靈注射液治療組:將清開靈注射液溶于60 mL生理鹽水，從家兔一側(cè)耳緣靜脈滴注LPS 的同時，從對側(cè)耳緣靜脈以 0．5 mL·kg－1·h－1的速度滴注清開靈注射液(10 mL/h)，連續(xù)6 h給藥。(4)中劑量清開靈注射液治療組:將清開靈注射液溶于60 mL生理鹽水，從家兔一側(cè)耳緣靜脈滴注LPS 的同時，從對側(cè)耳緣靜脈以 1．0 mL·kg－1·h－1的速度滴注清開靈注射液(10 mL/h)，連續(xù)6 h。(5)高劑量清開靈注射液治療組:將清開靈注射液溶于60 mL生理鹽水，從家兔一側(cè)耳緣靜脈滴注LPS的同時，從對側(cè)耳緣靜脈以 2．0 mL·kg－1·h－1的速度滴注清開靈注射液(10 mL/h)，連續(xù)6 h給藥。(6)肝素對照組:將肝素溶于60 mL生理鹽水中，從家兔一側(cè)耳緣靜脈滴注LPS的同時，從對側(cè)耳緣靜脈以6 ×105U·kg－1·h－1(10 mL/h)的速度滴注肝素，連續(xù)6 h。

3．4 觀察指標(biāo)和樣品的收集 在注射LPS前和注射2 h、6 h后分別從動脈取血1 mL，置于含有1/10體積的枸櫞酸鈉抗凝液的塑料管中，3 000 r/min離心10 min，分離血漿，待測血漿－20℃保存。用Sysmex CA1500+CA6000全自動凝血分析儀檢測活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT)、凝血酶原時間(prothrombin time，PT)和纖維蛋白原含量;用Sysmex SE－9500全自動血細胞分析儀進行血小板(platelet，PLT)計數(shù);用HITACHI 7170全自動血漿分析儀測定血漿ALT以及BUN含量;用發(fā)色底物法測定血漿蛋白C及ATⅢ的活性;用ELISA試劑盒檢測血漿TNF－α含量，同時記錄24 h內(nèi)各組動物生存率。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件對資料進行分析，用方差分析檢測各組差異是否顯著，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 清開靈注射液對LPS誘導(dǎo)的DIC兔生存率的影響

DIC模型組在24 h時的動物生存率為30%;清開靈注射液高、中、低劑量3組在24 h時的動物生存率分別為90%、50%和40%，見圖1。高劑量清開靈注射液治療組動物的24 h內(nèi)生存率明顯升高(P＜0．05 vs DIC)，見圖1;肝素組在24 h時的動物生存率為80%，見圖1;正常對照組動物在24 h時的動物生存率為100%(圖中未顯示)。

Figure 1．Effect of Qingkailing injection on survival rate of the rabbits with LPS－induced DIC．*P＜0．05 vs DIC．圖1 清開靈注射液對LPS誘導(dǎo)的DIC兔生存率的影響

2 清開靈注射液對LPS誘導(dǎo)的兔DIC凝血系統(tǒng)的影響

2．1 APTT和PT DIC模型組注射LPS2 h、6 h后，APTT分別為(20.52±6.12)s和(32.17±6.18)s，與正常對照組［(13.36±1.43)s和(14.30±1.02)s］比較均明顯延長(P＜0.05)，見表1;DIC模型組PT值分別為(16.24±5.31)s和(23.38±6.11)s，與正常對照組［(9.01±1.72)s和(9.53±1.32)s］比較均明顯延長(P＜0.05)，見表1。用清開靈注射液給藥2 h后，高劑量組APTT和PT明顯縮短;給藥6 h后，低劑量組和中高劑量組APTT顯著縮短，中劑量組和高劑量組PT顯著縮短(P＜0.05 vs DIC)，見表1。肝素組在給藥6 h后APTT和PT亦明顯縮短(P＜0.05 vs DIC)，見表1。

2．2 血小板計數(shù) DIC模型組注射LPS2 h、6 h后，血小板計數(shù)分別為(332.16±53.42)×109/L和(180.53±42.65)×109/L，與正常對照組［(465.71±70.87)×109/L和(482.21±94.90)×109/L］相比顯著下降(P＜0.05)，見表1。注射清開靈注射液2 h后，中高劑量組血小板計數(shù)明顯升高;給藥6 h后，各組血小板計數(shù)都顯著升高。肝素組在給藥2 h后血小板計數(shù)明顯升高，給藥6 h后顯著升高(P＜0.05 vs DIC)，見表 1。

2．3 纖維蛋白原含量 DIC模型組注射LPS 6 h后纖維蛋白原含量為(2.01±0.38)g/L，與正常對照組［(4.62±1.41)g/L］相比明顯降低(P ＜0.05)，見表1。注射清開靈注射液6 h后低劑量組纖維蛋白原含量明顯升高，中高劑量組纖維蛋白原含量顯著升高(P＜0.05 vs DIC)，見表1。肝素組在給藥6 h后纖維蛋白原含量明顯升高(P＜0.05 vs DIC)，見表1。

2．4 血漿蛋白C和抗凝血酶Ⅲ活性 DIC模型組注射LPS 2 h和6 h后，血漿蛋白 C水平分別為(52.73±15.30)%和(38.84±13.36)%，與正常對照組［(96.54±10.15)%和(98.32±7.63)%］相比明顯降低(P＜0.05)，見表1;抗凝血酶Ⅲ的活性水平分別為(76.18±15.32)%和(48.83±12.73)%，與正常對照組［(101.32±4.32)%和(98.42±5.01)%］相比明顯降低(P＜0.05)，見表1。注射清開靈注射液后，各組血漿蛋白C及抗凝血酶Ⅲ活性水平均顯著升高(P＜0.05 vs DIC)，見表1。肝素組在給藥后血漿蛋白C及抗凝血酶Ⅲ活性明顯升高(P＜0.05 vs DIC)，見表1。

表1 清開靈注射液對LPS誘導(dǎo)的兔DIC凝血系統(tǒng)的作用Table 1．Hemostatic parameters 2 h and 6 h after LPSinfusion into rabbits in different treatment groups(ˉx±s．n=10)

3 清開靈注射液對LPS誘導(dǎo)的兔DIC血漿ALT及BUN的影響

DIC模型組注射 LPS 2 h、6 h后血漿 ALT及BUN均明顯升高(與正常對照組相比);注射清開靈注射液2 h后，高劑量組血漿ALT活性與DIC模型組相比明顯下降(P＜0．05)，見圖2。注射清開靈注射液6 h后，各組血漿ALT活性與DIC模型組相比均明顯下降(P＜0．05)，見圖2。注射清開靈注射液6 h后，各組BUN與DIC模型組相比均明顯下降(P＜0．05)，見圖 3。

Figure 2．Effect of Qingkailing injection on the plasma level of ALT in LPS－induced DICrabbits．ˉx±s．n=10*P＜0．05 vs DIC group．圖2 清開靈注射液對LPS誘導(dǎo)的DIC兔血漿ALT活性的影響

Figure 3．Effect of Qingkailing injection on BUN in LPS－ induced DIC rabbits．ˉx±s．n=10．*P＜0．05 vs DIC group．圖3 清開靈注射液對LPS誘導(dǎo)的DIC兔BUN的影響

4 清開靈注射液對LPS誘導(dǎo)的兔DIC血漿TNF－α含量的影響

DIC模型組注射LPS 2 h、6 h后血漿TNF－α含量分別為(76．68 ±20．36)pg/L 和(436．82 ±42．67)pg/L，與正常對照組［(31．05 ±12．38)pg/L 和(38．26±10．73)pg/L］相比明顯升高(P ＜0．05)，見圖4。注射清開靈注射液2 h后，低中劑量TNF－α含量明顯降低，高劑量組顯著降低;給藥6 h后，各組TNF－α含量都顯著降低(P＜0．05 vs DIC)，見圖4。肝素組給藥2 h后TNF－α含量明顯降低，給藥6 h后TNF－α含量顯著降低(P＜0．05 vs DIC)，見圖4。

Figure 4．Effect of Qingkailing injection on the plasma levels of TNF－αin LPS－induced DICrabbits．ˉx±s．n=10．*P ＜0．05 vs DIC group．圖4 清開靈注射液對LPS誘導(dǎo)DIC兔血漿TNF－α含量的影響

討 論

DIC是由不同病理原因引起的綜合征，表現(xiàn)為全身性血管內(nèi)凝血系統(tǒng)激活和微血栓形成，臨床上以出血和血栓并存，以多器官功能衰竭為特征［1］。本實驗在靜脈持續(xù)滴注LPS后，APTT和PT呈進行性延長，血小板計數(shù)和纖維蛋白原含量顯著降低;ALT和BUN顯著升高;蛋白C和抗凝血酶Ⅲ的活性明顯降低;血漿TNF－α含量明顯升高。這符合DIC的病理生理過程，并與Hermida等［6］的研究結(jié)果一致。表明本研究建立了穩(wěn)定的兔DIC模型。

APTT能反映血漿凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ水平，是評價內(nèi)源凝血系統(tǒng)較為敏感和最常用的指標(biāo)，PT反映血漿中凝血因子Ⅱ、V、Ⅶ、X水平，是評價外源性凝血系統(tǒng)較為敏感和常用的指標(biāo)［8－9］。與DIC模型組相比，注射清開靈注射液后各組APTT和PT都明顯縮短，表明清開靈注射液能夠抑制DIC時凝血因子的消耗，提升血漿凝血因子水平。

血小板是凝血反應(yīng)的關(guān)鍵點，在DIC的發(fā)生發(fā)展過程中，由于凝血途徑的激活，凝血酶大量生成，導(dǎo)致了血小板聚集，從而使血小板減少。纖維蛋白原是凝血反應(yīng)的最終產(chǎn)物，也是血栓的主要成分［7］。與DIC模型組相比，注射清開靈注射液后各組的纖維蛋白原含量和血小板計數(shù)都明顯升高，并且隨著清開靈注射液劑量的增加，升高的程度更明顯。這提示清開靈注射液可以減輕DIC所致的凝血反應(yīng)、減少凝血物質(zhì)的消耗。

蛋白C是人體內(nèi)一種重要的抗凝因子，約占血液抗凝活性的20%～30%，其以無活性的酶原形式存在于血漿中，可在凝血酶作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨鞍證(activated protein C，APC);ATⅢ由肝細胞和血管內(nèi)皮細胞分泌，是人體內(nèi)另一重要的生理性抗凝物，生理條件下ATⅢ主要在血管內(nèi)皮細胞表面通過滅活凝血因子而發(fā)揮抗凝作用，其負責(zé)血漿中約7O%～75%的抗凝作用。DIC的發(fā)生可使蛋白C和ATⅢ活性減低，從而減弱其對于凝血反應(yīng)的抑制作用［10］。清開靈注射液使LPS所誘導(dǎo)的兔DIC的蛋白C和ATⅢ升高，提示清開靈注射液能夠增強抗凝物質(zhì)的作用來拮抗LPS所誘導(dǎo)的兔DIC的凝血反應(yīng)。

BUN是一種衡量腎小球濾過率的指標(biāo)，當(dāng)BUN升高時，提示腎實質(zhì)受損害;ALT是檢查肝功能的靈敏度較高的指標(biāo)，正常時血清含量很低，當(dāng)ALT升高時，提示肝細胞受到損害［11］。清開靈注射液使LPS所誘導(dǎo)的兔DIC的ALT和BUN顯著下降，提示清開靈注射液可以在LPS所誘導(dǎo)的兔DIC發(fā)生時保護腎實質(zhì)、減少肝細胞的破壞，從而減少肝臟腎臟等重要器官的損害。

促炎介質(zhì)在DIC發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用，各種促炎介質(zhì)通過活化內(nèi)皮細胞、促進凝血及補體活化等作用使機體產(chǎn)生全身炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致DIC的發(fā)生［11］。TNF－α是內(nèi)毒素血癥時一個早期的促炎因子，是誘發(fā)機體抵抗病原微生物的重要生物活性物質(zhì)，它可以誘導(dǎo)其它炎癥介質(zhì)的表達，從而在DIC的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［12］。持續(xù)的TNF－α高表達會造成嚴(yán)重的后果，如多器官功能衰竭和死亡［13］。與DIC模型組相比，用清開靈注射液所治療3組的血清TNF－α含量都明顯下降，隨著清開靈注射液劑量的增加，血清TNF－α含量下降的程度更加明顯。從而提示清開靈注射液可以通過減少促炎介質(zhì)的表達來起到對LPS所致的兔DIC的拮抗作用。

綜上所述，在LPS所致的兔DIC模型中，清開靈注射液可以使APTT和PT明顯縮短;血小板計數(shù)和纖維蛋白原含量明顯升高;蛋白C和抗凝血酶Ⅲ的活性明顯增強;ALT、BUN、TNF－α水平明顯降低。這可能是與清開靈注射液可以降低促炎因子的水平從而減少其它炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生、減少凝血物質(zhì)的消耗、抑制凝血系統(tǒng)的激活以及促進抗凝系統(tǒng)的激活有關(guān)。清開靈注射液可以保護LPS所致的DIC發(fā)生時肝腎等重要臟器，提高生存率，表明清開靈注射液對LPS所致的DIC有明顯的拮抗作用，在DIC的預(yù)防與早期治療中有良好的應(yīng)用前景。

［1］ Levi M．Current understanding of disseminated intravascular coagulation［J］．Br J HaematoI，2004，124(5):567 －576．

［2］ Watanabe R，Wada H，Miura Y，et al．Plasma levels of total plasminogen activator inhibitor－1(PAI－1)and tPA/PAI－1 complex in patients with disseminated intravascular coagulation and thrombotic thrombocytopenic purpura［J］．Clin Appl Thromb Hemost，2001，7(3):229 －233．

［3］ Ievi M，ten Cate H．Disseminated intravascular coagulation［J］．N Engl JMed，1999，341(8):586 －592．

［4］ 龐春紅，李澎濤，朱曉磊．腦缺血－再灌注相關(guān)細胞因子表達的TNF－α損傷機制及清開靈的作用［J］．世界中醫(yī)藥，2011，6(4):343 －346．

［5］ 金惠銘，王建枝．病理生理學(xué)［M］．第7版．北京:人民衛(wèi)生出版社，2008:163－194．

［6］ Hermida J，Montes R，Paramo JA，et al．Endotoxin － induced disseminated intravascular coagulation in rabbits:effect of recombinant hirudin on hemostatic parameters，fibrin deposits and mortality［J］．J Lab Clin Med，1998，131(I):77－83．

［7］ 林 熙，祈潔珍，邱鵬新，等．復(fù)方丹參注射液抗脂多糖誘導(dǎo)的兔彌漫性血管內(nèi)凝血［J］．中國病理生理雜志，2011，27(3):464 －468．

［8］ 托馬斯．臨床實驗診斷學(xué)［M］．上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2004:558－559．

［9］ 李基明，林 健，黃革玲，等．臨產(chǎn)孕婦凝血四項指標(biāo)檢測的臨床意義［J］．實用臨床醫(yī)學(xué)，2006，7(1):88 －89．

［10］ 劉宇明，許治強，周伯榮，等．蛋白C、抗凝血酶Ⅲ在缺血性腦血管病發(fā)病機制中的作用［J］．中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志，2011，8(5):379 －380．

［11］ 陳文彬，潘祥林．診斷學(xué)［M］．第7版．北京:人民衛(wèi)生出版社，2010:351－367．

［12］ 張華莉，劉 瑛，王秋鵬，等．熱休克反應(yīng)和熱休克轉(zhuǎn)錄因子1對LPS誘導(dǎo)的TNF－α和IL－15表達的影響［J］．醫(yī)學(xué)臨床研究，2004，21(1):18 －21．

［13］ Beutler B，Milsark IW，Cerami AC．Passive immunization against cachectin/tumor necrosis factor protects mice from lethal effect of endotoxin［J］．Science，1985，229(4716):869－871．