清開(kāi)靈注射液對(duì)LPS誘導(dǎo)的兔彌散性血管內(nèi)凝血的作用*

孫 浩，王 珣，柳佳利，林 熙

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，廣東廣州510632)

彌散性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)是由不同病理原因引起的、無(wú)明確定位的全身性血管內(nèi)凝血系統(tǒng)激活和微血栓形成，臨床上以出血和血栓并存，以及多器官功能衰竭為特征的綜合征［1］。目前已證明DIC和炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，在危重的DIC患者中，炎癥反應(yīng)在其病理生理進(jìn)展中發(fā)揮重要作用［2－3］。DIC具有起病急驟、發(fā)展迅速、預(yù)后極差、死亡率高的特點(diǎn)。目前臨床上對(duì)其主要采用抗凝治療，其代表類藥物為肝素。但應(yīng)用肝素治療時(shí)副作用明顯，常可加重患者出血傾向。

清開(kāi)靈注射液為中成藥制劑，主要成分為膽酸、珍珠母、豬去氧膽酸、板蘭根、金銀花等。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)清開(kāi)靈注射液能夠通過(guò)抑制全身炎癥介質(zhì)所介導(dǎo)的炎癥細(xì)胞黏附以及內(nèi)皮損傷，從而有效的減輕全身炎癥反應(yīng)［4］。以上提示清開(kāi)靈注射液可能可以通過(guò)減輕全身炎癥反應(yīng)來(lái)起到抗DIC的作用。

DIC的治療主要針對(duì)高凝期，此期凝血系統(tǒng)被激活，凝血酶產(chǎn)生增多，血液中凝血酶含量增高，血液表現(xiàn)為高凝狀態(tài)，微循環(huán)中形成大量微血栓，易造成血管栓塞以及多器官功能衰竭［5］。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的DIC模型主要是模擬DIC的高凝期，本課題組擬通過(guò)注射LPS建立家兔DIC模型，觀察家兔凝血系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)以及血漿丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、血尿素氮(blood urine nitroge，BUN)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF－α)的變化，從而證實(shí)清開(kāi)靈注射液對(duì)LPS誘導(dǎo)家兔DIC的拮抗作用。

材料和方法

1 動(dòng)物

健康雄性新西蘭家兔60只，體重2．0～2．5 kg，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，粵檢證字［SCXK(粵)2008－0002］。

2 試劑及儀器設(shè)備

清開(kāi)靈注射液購(gòu)于北京中醫(yī)藥大學(xué)藥廠，批號(hào)611013A;LPS購(gòu)于Sigma;肝素購(gòu)于中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)有限公司;蛋白C和抗凝血酶Ⅲ(antithormbinⅢ，ATⅢ)活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海太陽(yáng)生物技術(shù)公司;ELISA試劑盒(tumor necrosis factorα，TNF－α)購(gòu)于BD Biosciences。Sysmex CA1500+CA6000全自動(dòng)凝血分析儀(KOBE);Sysmex SE－9500全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(KOBE);HITACHI 7170全自動(dòng)血漿分析儀(HITACHI)。

3 主要方法

3．1 動(dòng)物模型的建立 參照Hermida等［6］方法，用LPS誘導(dǎo)家兔DIC。3%戊巴比妥鈉按30 mg/kg從家兔耳緣靜脈注射麻醉，分離右側(cè)頸動(dòng)脈、插管，以備取血。LPS溶于60 mL生理鹽水中，然后以100 μg·kg－1·h－1(10 mL/h)的速度從家兔耳緣靜脈滴注，連續(xù)6 h給藥，建立穩(wěn)定的家兔DIC模型。給藥后2 h、4 h給予戊巴比妥鈉腹腔注射，維持動(dòng)物的持續(xù)麻醉狀態(tài)。

3．2 動(dòng)物分組 將家兔隨機(jī)分6組，每組10只(1)正常對(duì)照組:(2)DIC模型組:(3)低劑量清開(kāi)靈注射液治療組;(4)中劑量清開(kāi)靈注射液治療組;(5)高劑量清開(kāi)靈注射液治療組;(6)肝素對(duì)照組。

3．3 給藥方法 (1)正常對(duì)照組:從家兔雙側(cè)耳緣靜脈以10 mL/h的速度滴注生理鹽水(既不注射LPS，也不注射清開(kāi)靈注射液和肝素，連續(xù)6 h)。(2)DIC模型組:從家兔一側(cè)耳緣靜脈以100μg·kg－1·h－1(10 mL/h)的速度滴注 LPS，同時(shí)從對(duì)側(cè)耳緣靜脈以10 mL/h的速度滴注生理鹽水，連續(xù)6 h。(3)低劑量清開(kāi)靈注射液治療組:將清開(kāi)靈注射液溶于60 mL生理鹽水，從家兔一側(cè)耳緣靜脈滴注LPS 的同時(shí)，從對(duì)側(cè)耳緣靜脈以 0．5 mL·kg－1·h－1的速度滴注清開(kāi)靈注射液(10 mL/h)，連續(xù)6 h給藥。(4)中劑量清開(kāi)靈注射液治療組:將清開(kāi)靈注射液溶于60 mL生理鹽水，從家兔一側(cè)耳緣靜脈滴注LPS 的同時(shí)，從對(duì)側(cè)耳緣靜脈以 1．0 mL·kg－1·h－1的速度滴注清開(kāi)靈注射液(10 mL/h)，連續(xù)6 h。(5)高劑量清開(kāi)靈注射液治療組:將清開(kāi)靈注射液溶于60 mL生理鹽水，從家兔一側(cè)耳緣靜脈滴注LPS的同時(shí)，從對(duì)側(cè)耳緣靜脈以 2．0 mL·kg－1·h－1的速度滴注清開(kāi)靈注射液(10 mL/h)，連續(xù)6 h給藥。(6)肝素對(duì)照組:將肝素溶于60 mL生理鹽水中，從家兔一側(cè)耳緣靜脈滴注LPS的同時(shí)，從對(duì)側(cè)耳緣靜脈以6 ×105U·kg－1·h－1(10 mL/h)的速度滴注肝素，連續(xù)6 h。

3．4 觀察指標(biāo)和樣品的收集 在注射LPS前和注射2 h、6 h后分別從動(dòng)脈取血1 mL，置于含有1/10體積的枸櫞酸鈉抗凝液的塑料管中，3 000 r/min離心10 min，分離血漿，待測(cè)血漿－20℃保存。用Sysmex CA1500+CA6000全自動(dòng)凝血分析儀檢測(cè)活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time，APTT)、凝血酶原時(shí)間(prothrombin time，PT)和纖維蛋白原含量;用Sysmex SE－9500全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀進(jìn)行血小板(platelet，PLT)計(jì)數(shù);用HITACHI 7170全自動(dòng)血漿分析儀測(cè)定血漿ALT以及BUN含量;用發(fā)色底物法測(cè)定血漿蛋白C及ATⅢ的活性;用ELISA試劑盒檢測(cè)血漿TNF－α含量，同時(shí)記錄24 h內(nèi)各組動(dòng)物生存率。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)資料進(jìn)行分析，用方差分析檢測(cè)各組差異是否顯著，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 清開(kāi)靈注射液對(duì)LPS誘導(dǎo)的DIC兔生存率的影響

DIC模型組在24 h時(shí)的動(dòng)物生存率為30%;清開(kāi)靈注射液高、中、低劑量3組在24 h時(shí)的動(dòng)物生存率分別為90%、50%和40%，見(jiàn)圖1。高劑量清開(kāi)靈注射液治療組動(dòng)物的24 h內(nèi)生存率明顯升高(P＜0．05 vs DIC)，見(jiàn)圖1;肝素組在24 h時(shí)的動(dòng)物生存率為80%，見(jiàn)圖1;正常對(duì)照組動(dòng)物在24 h時(shí)的動(dòng)物生存率為100%(圖中未顯示)。

Figure 1．Effect of Qingkailing injection on survival rate of the rabbits with LPS－induced DIC．*P＜0．05 vs DIC．圖1 清開(kāi)靈注射液對(duì)LPS誘導(dǎo)的DIC兔生存率的影響

2 清開(kāi)靈注射液對(duì)LPS誘導(dǎo)的兔DIC凝血系統(tǒng)的影響

2．1 APTT和PT DIC模型組注射LPS2 h、6 h后，APTT分別為(20.52±6.12)s和(32.17±6.18)s，與正常對(duì)照組［(13.36±1.43)s和(14.30±1.02)s］比較均明顯延長(zhǎng)(P＜0.05)，見(jiàn)表1;DIC模型組PT值分別為(16.24±5.31)s和(23.38±6.11)s，與正常對(duì)照組［(9.01±1.72)s和(9.53±1.32)s］比較均明顯延長(zhǎng)(P＜0.05)，見(jiàn)表1。用清開(kāi)靈注射液給藥2 h后，高劑量組APTT和PT明顯縮短;給藥6 h后，低劑量組和中高劑量組APTT顯著縮短，中劑量組和高劑量組PT顯著縮短(P＜0.05 vs DIC)，見(jiàn)表1。肝素組在給藥6 h后APTT和PT亦明顯縮短(P＜0.05 vs DIC)，見(jiàn)表1。

2．2 血小板計(jì)數(shù) DIC模型組注射LPS2 h、6 h后，血小板計(jì)數(shù)分別為(332.16±53.42)×109/L和(180.53±42.65)×109/L，與正常對(duì)照組［(465.71±70.87)×109/L和(482.21±94.90)×109/L］相比顯著下降(P＜0.05)，見(jiàn)表1。注射清開(kāi)靈注射液2 h后，中高劑量組血小板計(jì)數(shù)明顯升高;給藥6 h后，各組血小板計(jì)數(shù)都顯著升高。肝素組在給藥2 h后血小板計(jì)數(shù)明顯升高，給藥6 h后顯著升高(P＜0.05 vs DIC)，見(jiàn)表 1。

2．3 纖維蛋白原含量 DIC模型組注射LPS 6 h后纖維蛋白原含量為(2.01±0.38)g/L，與正常對(duì)照組［(4.62±1.41)g/L］相比明顯降低(P ＜0.05)，見(jiàn)表1。注射清開(kāi)靈注射液6 h后低劑量組纖維蛋白原含量明顯升高，中高劑量組纖維蛋白原含量顯著升高(P＜0.05 vs DIC)，見(jiàn)表1。肝素組在給藥6 h后纖維蛋白原含量明顯升高(P＜0.05 vs DIC)，見(jiàn)表1。

2．4 血漿蛋白C和抗凝血酶Ⅲ活性 DIC模型組注射LPS 2 h和6 h后，血漿蛋白 C水平分別為(52.73±15.30)%和(38.84±13.36)%，與正常對(duì)照組［(96.54±10.15)%和(98.32±7.63)%］相比明顯降低(P＜0.05)，見(jiàn)表1;抗凝血酶Ⅲ的活性水平分別為(76.18±15.32)%和(48.83±12.73)%，與正常對(duì)照組［(101.32±4.32)%和(98.42±5.01)%］相比明顯降低(P＜0.05)，見(jiàn)表1。注射清開(kāi)靈注射液后，各組血漿蛋白C及抗凝血酶Ⅲ活性水平均顯著升高(P＜0.05 vs DIC)，見(jiàn)表1。肝素組在給藥后血漿蛋白C及抗凝血酶Ⅲ活性明顯升高(P＜0.05 vs DIC)，見(jiàn)表1。

表1 清開(kāi)靈注射液對(duì)LPS誘導(dǎo)的兔DIC凝血系統(tǒng)的作用Table 1．Hemostatic parameters 2 h and 6 h after LPSinfusion into rabbits in different treatment groups(ˉx±s．n=10)

3 清開(kāi)靈注射液對(duì)LPS誘導(dǎo)的兔DIC血漿ALT及BUN的影響

DIC模型組注射 LPS 2 h、6 h后血漿 ALT及BUN均明顯升高(與正常對(duì)照組相比);注射清開(kāi)靈注射液2 h后，高劑量組血漿ALT活性與DIC模型組相比明顯下降(P＜0．05)，見(jiàn)圖2。注射清開(kāi)靈注射液6 h后，各組血漿ALT活性與DIC模型組相比均明顯下降(P＜0．05)，見(jiàn)圖2。注射清開(kāi)靈注射液6 h后，各組BUN與DIC模型組相比均明顯下降(P＜0．05)，見(jiàn)圖 3。

Figure 2．Effect of Qingkailing injection on the plasma level of ALT in LPS－induced DICrabbits．ˉx±s．n=10*P＜0．05 vs DIC group．圖2 清開(kāi)靈注射液對(duì)LPS誘導(dǎo)的DIC兔血漿ALT活性的影響

Figure 3．Effect of Qingkailing injection on BUN in LPS－ induced DIC rabbits．ˉx±s．n=10．*P＜0．05 vs DIC group．圖3 清開(kāi)靈注射液對(duì)LPS誘導(dǎo)的DIC兔BUN的影響

4 清開(kāi)靈注射液對(duì)LPS誘導(dǎo)的兔DIC血漿TNF－α含量的影響

DIC模型組注射LPS 2 h、6 h后血漿TNF－α含量分別為(76．68 ±20．36)pg/L 和(436．82 ±42．67)pg/L，與正常對(duì)照組［(31．05 ±12．38)pg/L 和(38．26±10．73)pg/L］相比明顯升高(P ＜0．05)，見(jiàn)圖4。注射清開(kāi)靈注射液2 h后，低中劑量TNF－α含量明顯降低，高劑量組顯著降低;給藥6 h后，各組TNF－α含量都顯著降低(P＜0．05 vs DIC)，見(jiàn)圖4。肝素組給藥2 h后TNF－α含量明顯降低，給藥6 h后TNF－α含量顯著降低(P＜0．05 vs DIC)，見(jiàn)圖4。

Figure 4．Effect of Qingkailing injection on the plasma levels of TNF－αin LPS－induced DICrabbits．ˉx±s．n=10．*P ＜0．05 vs DIC group．圖4 清開(kāi)靈注射液對(duì)LPS誘導(dǎo)DIC兔血漿TNF－α含量的影響

討 論

DIC是由不同病理原因引起的綜合征，表現(xiàn)為全身性血管內(nèi)凝血系統(tǒng)激活和微血栓形成，臨床上以出血和血栓并存，以多器官功能衰竭為特征［1］。本實(shí)驗(yàn)在靜脈持續(xù)滴注LPS后，APTT和PT呈進(jìn)行性延長(zhǎng)，血小板計(jì)數(shù)和纖維蛋白原含量顯著降低;ALT和BUN顯著升高;蛋白C和抗凝血酶Ⅲ的活性明顯降低;血漿TNF－α含量明顯升高。這符合DIC的病理生理過(guò)程，并與Hermida等［6］的研究結(jié)果一致。表明本研究建立了穩(wěn)定的兔DIC模型。

APTT能反映血漿凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ水平，是評(píng)價(jià)內(nèi)源凝血系統(tǒng)較為敏感和最常用的指標(biāo)，PT反映血漿中凝血因子Ⅱ、V、Ⅶ、X水平，是評(píng)價(jià)外源性凝血系統(tǒng)較為敏感和常用的指標(biāo)［8－9］。與DIC模型組相比，注射清開(kāi)靈注射液后各組APTT和PT都明顯縮短，表明清開(kāi)靈注射液能夠抑制DIC時(shí)凝血因子的消耗，提升血漿凝血因子水平。

血小板是凝血反應(yīng)的關(guān)鍵點(diǎn)，在DIC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，由于凝血途徑的激活，凝血酶大量生成，導(dǎo)致了血小板聚集，從而使血小板減少。纖維蛋白原是凝血反應(yīng)的最終產(chǎn)物，也是血栓的主要成分［7］。與DIC模型組相比，注射清開(kāi)靈注射液后各組的纖維蛋白原含量和血小板計(jì)數(shù)都明顯升高，并且隨著清開(kāi)靈注射液劑量的增加，升高的程度更明顯。這提示清開(kāi)靈注射液可以減輕DIC所致的凝血反應(yīng)、減少凝血物質(zhì)的消耗。

蛋白C是人體內(nèi)一種重要的抗凝因子，約占血液抗凝活性的20%～30%，其以無(wú)活性的酶原形式存在于血漿中，可在凝血酶作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨鞍證(activated protein C，APC);ATⅢ由肝細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌，是人體內(nèi)另一重要的生理性抗凝物，生理?xiàng)l件下ATⅢ主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面通過(guò)滅活凝血因子而發(fā)揮抗凝作用，其負(fù)責(zé)血漿中約7O%～75%的抗凝作用。DIC的發(fā)生可使蛋白C和ATⅢ活性減低，從而減弱其對(duì)于凝血反應(yīng)的抑制作用［10］。清開(kāi)靈注射液使LPS所誘導(dǎo)的兔DIC的蛋白C和ATⅢ升高，提示清開(kāi)靈注射液能夠增強(qiáng)抗凝物質(zhì)的作用來(lái)拮抗LPS所誘導(dǎo)的兔DIC的凝血反應(yīng)。

BUN是一種衡量腎小球?yàn)V過(guò)率的指標(biāo)，當(dāng)BUN升高時(shí)，提示腎實(shí)質(zhì)受損害;ALT是檢查肝功能的靈敏度較高的指標(biāo)，正常時(shí)血清含量很低，當(dāng)ALT升高時(shí)，提示肝細(xì)胞受到損害［11］。清開(kāi)靈注射液使LPS所誘導(dǎo)的兔DIC的ALT和BUN顯著下降，提示清開(kāi)靈注射液可以在LPS所誘導(dǎo)的兔DIC發(fā)生時(shí)保護(hù)腎實(shí)質(zhì)、減少肝細(xì)胞的破壞，從而減少肝臟腎臟等重要器官的損害。

促炎介質(zhì)在DIC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用，各種促炎介質(zhì)通過(guò)活化內(nèi)皮細(xì)胞、促進(jìn)凝血及補(bǔ)體活化等作用使機(jī)體產(chǎn)生全身炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致DIC的發(fā)生［11］。TNF－α是內(nèi)毒素血癥時(shí)一個(gè)早期的促炎因子，是誘發(fā)機(jī)體抵抗病原微生物的重要生物活性物質(zhì)，它可以誘導(dǎo)其它炎癥介質(zhì)的表達(dá)，從而在DIC的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用［12］。持續(xù)的TNF－α高表達(dá)會(huì)造成嚴(yán)重的后果，如多器官功能衰竭和死亡［13］。與DIC模型組相比，用清開(kāi)靈注射液所治療3組的血清TNF－α含量都明顯下降，隨著清開(kāi)靈注射液劑量的增加，血清TNF－α含量下降的程度更加明顯。從而提示清開(kāi)靈注射液可以通過(guò)減少促炎介質(zhì)的表達(dá)來(lái)起到對(duì)LPS所致的兔DIC的拮抗作用。

綜上所述，在LPS所致的兔DIC模型中，清開(kāi)靈注射液可以使APTT和PT明顯縮短;血小板計(jì)數(shù)和纖維蛋白原含量明顯升高;蛋白C和抗凝血酶Ⅲ的活性明顯增強(qiáng);ALT、BUN、TNF－α水平明顯降低。這可能是與清開(kāi)靈注射液可以降低促炎因子的水平從而減少其它炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生、減少凝血物質(zhì)的消耗、抑制凝血系統(tǒng)的激活以及促進(jìn)抗凝系統(tǒng)的激活有關(guān)。清開(kāi)靈注射液可以保護(hù)LPS所致的DIC發(fā)生時(shí)肝腎等重要臟器，提高生存率，表明清開(kāi)靈注射液對(duì)LPS所致的DIC有明顯的拮抗作用，在DIC的預(yù)防與早期治療中有良好的應(yīng)用前景。

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