創傷后應激障礙大鼠海馬分子伴侶葡萄糖調節蛋白94表達的變化

謝菊華，韓芳，石玉秀

（中國醫科大學基礎醫學院組織學與胚胎學教研室，沈陽 1 1 0 0 0 1）

創傷后應激障礙（posttraumatic stress disorder，PTSD）是指經歷了巨大生命威脅或對身心有嚴重損害事件后發生的一系列精神心理綜合征［1］，目前發病機制尚不清楚。葡萄糖調節蛋白（glucose-regulated protein，GRP）94屬于熱休克蛋白90家族，是常見的內質網分子伴侶，在鈣穩態維持，蛋白質合成、降解，啟動內質網應激—未折疊蛋白反應以及內質網徑路細胞凋亡上具有重要作用［2，3］。本研究擬采用免疫組織化學、Western blot、RT-PCR方法檢測PTSD大鼠海馬神經元GRP94的表達變化，旨在為進一步探討內質網應激、內質網徑路細胞凋亡在PTSD發病機制中的作用提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物及分組：健康成年雄性Wistar大鼠45只（中國醫科大學實驗動物中心提供），體質量150~220 g，平均（180±20）g。常規喂養 7 d 后，隨機分為正常對照（nd）組、SPS模型 7 d（sps-7d）組、SPS模型 14 d（sps-14d）組，每組各 15 只。

1.1.2 單一延長應激（single-prolonged stress，SPS）模型制備［4］：將大鼠頭朝瓶嘴固定于塑料瓶中，尾巴暴露在外，膠帶捆緊，水平放置禁錮2 h。拆除塑料瓶，直接將大鼠投入水深 30 cm、水溫（24±2）℃的矩形水槽中，計時20 min。讓大鼠休息15 min后，置入乙醚缸內麻醉至意識喪失。隨后將大鼠放回籠中，常規飼養至取材。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化：每組各取大鼠5只，常規0.4%戊巴比妥腹腔麻醉后暴露心臟，于左心室插管，并剪開右心耳，用37℃預熱的0.9%氯化鈉溶液灌流沖洗血道至流出液無色。隨后用4%多聚甲醛灌流固定至大鼠四肢僵直、肝臟發硬。取出大鼠腦組織，4%多聚甲醛后固定至少12 h。常規脫水、石蠟包埋、切片待用（厚度 7 μm）。60℃烤片 2 h；脫蠟、梯度乙醇；用30%過氧化氫（1份）+蒸餾水（10份）去除內源性過氧化物酶；0.3%Triton洗10 min；枸櫞酸/枸櫞酸鈉緩沖液高壓熱修復2.5 min；0.01 mol/L PBS液漂洗5 min×3次；滴加5%BSA，20 min后分別滴加兔來源多克隆GRP94一抗（Santa Cruz Biotechnology，美國，1︰200稀釋），4℃過夜；0.01 mol/L PBS液漂洗 5 min×3次后滴加二抗（武漢博士德SABC試劑盒），37℃恒溫箱中孵育30 min；0.01 mol/L PBS液漂洗5 min×3次后滴加HRP標記的SABC孵育20 min，洗滌，DAB顯色，脫水、透明、封片，于光學顯微鏡（OLYMPUS，BX60，日本）下觀察并照相。以 Meta－Morph/DPIO/BX41形態學圖象分析系統軟件進行圖像積分光密度（integral optical density，IOD）半定量分析。

1.2.2 Western blot：每組取5只大鼠，快速斷頭，冰上取海馬。勻漿、超聲粉碎后，于4℃下12 000 r/min離心30 min，取上清，-20℃保存備用。根據Bradford法檢測蛋白濃度，取50 μg樣品蛋白于12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳，濕法轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉常溫搖床封閉2 h。加入一抗（GRP94一抗：Santa Cruz Biotechnology，美國，兔來源多克隆抗體，1︰200稀釋；GAPDH一抗：北京中杉金橋公司，兔來源多克隆抗體，1︰500稀釋）4℃過夜；常溫下復溫30 min后，TBST洗15 min×3次，HRP標記的二抗（均為北京中杉金橋，羊抗兔，1︰2 000）常溫下孵育2 h；TBST洗15 min×3次，ECL顯色，圖像分析。采用Image J分析軟件進行蛋白水平半定量分析。每組獨立實驗重復至少3次，取平均值。目的條帶與內參照蛋白GAPDH平均灰度值比值即GRP94/GAPDH蛋白水平。

1.2.3 RT-PCR：每組取5只大鼠，冰上直接斷頭取海馬組織。按Trizol試劑盒說明書提取總RNA，測定濃度和純度，依據RT-PCR試劑盒（TaKaRa公司，美國）逆轉錄為cDNA。根據Prime 5.0軟件設計出GRP94引物序列：上游5′-GACGGGCAAGGACATT ACAAA-3′，下游 5′-CTTCTTCTTCTGCCCCTGCGTC TG-3′，擴增片段長度362 bp，退火溫度為56℃，循環次數30次。內參照β-actin引物序列：上游5′-ATCACCCACACTGTGCCCATC-3， 下 游 5′-ACAGAGTACTTGCGCTCAGGA-3′，擴增片段長度542 bp，退火溫度為58℃，循環次數30次。取PCR產物5 μL行2.0%瓊脂糖凝膠電泳，用天能2500R凝膠成像分析儀進行成像、數據分析。mRNA相對定量為PCR產物掃描值與β-actin掃描值的比值。1.3 統計學分析

采用SPSS11.5軟件進行統計分析。定量資料用x±s表示，組間采取單因素方差分析。檢驗水準取α=0.05。

2 結果

2.1 免疫組化結果

GRP94免疫組化陽性產物主要表達于神經元核周質中，為棕黃色。nd組、sps-7d組和sps-14d組免疫組化結果如圖1所示：SPS模型大鼠GRP94蛋白的表達在建模后第7天有明顯升高（IOD：11.63±1.77，P<0.05），；第 14天時表達降低（IOD：6.96±1.89，P<0.05），但仍較正常 IOD 水平（6.05±1.85）稍高。

2.2 Western blot結果

GRP94蛋白分子量約為94 kDa，GAPDH蛋白分子量約為36 kDa。建立SPS模型后第7天，GRP94相對表達量（0.59±0.03）明顯高于正常對照組（0.27±0.03）（P<0.05）；建模后第 14 天，GRP94相對表達量（0.41±0.02）明顯低于第 7天（P<0.05）。見圖2。

2.3 RT-PCR結果

RT-PCR結果顯示：sps-7d組GRP94mRNA相對表達量（0.88±0.07）較 nd組（0.32±0.04）明顯升高（P<0.05，圖 3），sps-14d 組相對表達量（0.44±0.09）較sps-7d組明顯降低（P<0.05），但未恢復nd組水平。

3 討論

隨著國內外自然災害、恐怖襲擊等重大突發事件的增加，PTSD發病率顯著上升。據流行病學研究調查發現，我國汶川地震損害嚴重的地區PTSD發生率高達45.5%，已遠遠超過伊拉克戰爭中戰士PTSD的發生率（12.2%）［5］。PTSD已成為關系社會公眾健康的重要的公共衛生問題［6］，因此，PTSD發病機制的研究備受國內外關注。

目前許多臨床影像學研究發現PTSD發病與海馬體積縮小有關，PTSD發病可能是海馬神經元遭遇巨大損害后自身修復障礙并最終引起細胞凋亡所致［7~9］。鑒于PTSD發病與巨大應激源刺激相關，而內質網對細胞內外環境變化最為敏感，我們推測引發PTSD的巨大應激源可能通過觸發內質網應激機制、激活未折疊蛋白反應，導致內質網自穩功能失調，最終可能啟動了內質網徑路細胞凋亡而致海馬神經元死亡、海馬體積縮小。GRP94是常見的內質網分子伴侶之一，屬于熱休克蛋白90家族。GRP94在蛋白質合成、分泌的信號轉導及抑制鈣離子耗竭中起重要作用［10］，它通過感受內質網應激激活信號，激活內質網未折疊蛋白反應、結合錯誤折疊蛋白及未折疊蛋白，用以應對內質網應激、協助蛋白質的正確折疊，同時，GRP94在內質網應激所致細胞死亡中也發揮了一定的抗凋亡作用［11，12］。

本研究結果發現：經禁錮、強迫游泳、乙醚麻醉后常規喂養7 d的Wistar大鼠海馬錐體細胞中GRP94蛋白陽性表達量較正常對照組明顯增加（P<0.05）；sps-7d組大鼠海馬GRP94mRNA表達量相對增多（P<0.05），提示PTSD大鼠海馬神經元確實發生了GRP94的表達改變，這種改變可能與海馬神經元啟動內質網應激機制，內質網分子伴侶GRP94轉錄與翻譯水平均反應性增加有關。而SPS14 d后GRP94蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），mRNA表達也相對減少（P<0.05），但仍稍高于正常水平，這可能與海馬神經元無法通過內質網應激恢復細胞損傷，神經元功能受損，蛋白質合成減少及細胞自穩調節機制異常有關。同時也說明GRP94可能參與了PTSD大鼠海馬神經元內質網應激后的功能自我修復，可能是SPS刺激后海馬神經元功能難以修復后引發內質網徑路細胞凋亡、海馬體積縮小的重要分子機制。

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