細胞周期蛋白激酶抑制劑flavopiridol對骨肉瘤耐藥細胞MG63/ADR增殖抑制的體內外實驗研究

李旭，李巖，程世孝，李雷明，孟凡賀，朱悅，范廣宇

（中國醫科大學附屬第一醫院骨科，沈陽 1 1 0 0 0 1）

骨肉瘤是好發于青少年的常見原發性惡性骨腫瘤。盡管隨著新輔助化療、保肢體手術等綜合治療手段的開展，治療成績不斷提高，但是仍有30%～40%的患者在接受初期大劑量輔助化療后出現不伴有遠隔轉移的局部復發，考慮為腫瘤細胞出現耐藥導致預后不良所致［1，2］。因此，在抗腫瘤治療策略研發進程中，尋找具有抗腫瘤活性同時又能夠對抗甚至逆轉多藥耐藥活性的藥物受到人們關注。前期研究表明，細胞周期蛋白激酶抑制劑flavopiridol可以有效抑制尤文肉瘤敏感細胞株以及耐藥細胞株的增殖，并誘導其凋亡［3，4］。本研究中，我們觀察該藥物在體外、體內對骨肉瘤耐藥細胞MG63/ADR的細胞增殖抑制效果及機制，旨在為細胞周期蛋白激酶抑制劑（cyclin dependent kinase inhibitor，CDKI）抑制骨肉瘤的耐藥及復發提供新的理論依據。

1 材料與方法

1．1 試劑與儀器

Flavopiridol（由美國Aventis公司Jose-Ramon博士惠贈）以二甲基亞砜（DMSO，Sunland-chem公司）溶解，-20℃冰凍保存，保存初始濃度為10 mmol/L。RPMI培養液、小牛血清（美國Gibco公司）、噻唑藍（MTT，Genview 公司）、碘化丙錠（PI，Sigma公司）、Triton-X100（Quantum公司）。

1．2 靶細胞與細胞培養

骨肉瘤敏感細胞株MG63及骨肉瘤耐藥細胞株（MG63/ADR）為阿霉素（adriamycin，ADM）誘導的P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）及多藥耐藥蛋白1（multidrug resistance protein1，MRP1）超表達的骨肉瘤多藥耐藥細胞［5］，為日本Kyushu大學小田義直教授贈與。將MG-63/ADR細胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的細胞培養液，在37℃、飽和濕度、5%CO2培養箱中常規培養，隔日換液，用含0.125%胰酶和0.02%EDTA消化液隔天消化、傳代，定期添加ADM（100 ng/mL）以維持P-gp高表達。

1．3 細胞增殖活性測定

將MG63及MG63/ADR細胞濃度調整為1×107/L，轉入96孔板培養，100 μL/孔，24 h后，加入細胞和同等稀釋度的DMSO為陰性對照組，ADM組濃度分別為 10，100，1 000，2 000，4 000，10 000，20 000，40 000，100 000 ng/mL，flavopiridol組濃度分別為 5，10，20，40，80，160，320，640，1280，2 560，5 120，10 240 nmol/L，9孔/組，每隔 24 h終止培養 3孔，72 h后結束全部實驗。結束培養前每孔加入MTT 20 μL（濃度為5 g/L），置入培養箱3~4 h后離心，去上清液，加入 DMSO，每孔 200 μL，遮光下低速振蕩 10 min，在酶聯檢測儀測定各組570 nm處OD值，描繪細胞增殖曲線，計算細胞生長抑制率、藥物的IC50及耐藥倍數。細胞生長抑制率=1-（Aflavopiridol組-A空白組）/（AADM組-A空白組）×100%；耐藥倍數=IC50耐藥細胞/IC50敏感細胞。實驗重復3次。

1.4 細胞周期測定

實驗組和陰性對照組各設3個平行培養皿。Flavopiridol作用48 h后（濃度分別為100 nmol/L，200 nmol/L，400 nmol/L），每組收集 5×105個細胞，PBS液漂洗離心后，加入70%冷乙醇4℃固定至少24 h，檢測前0.5%TritonX-100及RNase酶處理，調細胞數至1×105/mL，加入PI染色液1 mL，37℃孵育30 min，4℃染30 min，于流式細胞儀上測定細胞周期，數據經LvsisⅡ軟件收集并分析。實驗重復3次。

1.5 免疫印跡法測定

檢測給藥后 pro-caspase-9、pro-caspase-3、caspase-8、Bcl-2、Bcl-xL、p53、Bax以及 cleaved-PARP 表達水平的變化。收集對照組和經不同濃度flavopiridol處理48 h的細胞（濃度分別為100 nmol/L，200 nmol/L，400 nmol/L），以細胞裂解液裂解，提取蛋白并定量后，分別取50 μg加入上樣緩沖液，經95℃變性10 min，8%～12%的聚丙烯酰胺-SDS凝膠電泳后，轉移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h后，加一抗室溫孵育2 h；TBST洗滌3次，每次10 min，二抗（辣根過氧化物酶標記，1∶2 000稀釋）室溫孵育2 h；TBST洗滌3次，加入ECL化學發光試劑后放入暗盒中壓片并依次顯影、固定、照相。實驗重復3次。

1.6 裸小鼠皮下種植瘤模型制作

取5周齡BALB/C裸鼠30只，制備細胞懸液（2×108/mL），每只裸鼠背部皮下注射細胞懸液0.1 mL。8 d后27只小鼠出現皮下結節（直徑5～6 mm）。將造模成功裸鼠隨機分為對照組（9只），5 mg·kg-1·d-1組（9只）和7.5 mg·kg-1·d-1組（9只），實驗組分別每天腹腔內注射flavopiridol（5 mg/kg和7.5 mg/kg），對照組注射同體積PBS緩沖液，連續5 d。每3天測量1次腫瘤長徑（a）和短徑（b），計算腫瘤體積：V=a×b2/2。成瘤后觀察4周，繪制腫瘤生長曲線。腫瘤生長抑制率=（1-處理組瘤質量/對照組瘤質量）×100%。并每周測量裸鼠體質量。

1.7 統計學分析

采用SPSS 10.0軟件，實驗數據以x±s表示。采用單因素方差分析（ANOVA），P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Flavopiridol對骨肉瘤耐藥細胞增殖影響

MTT試驗結果顯示，ADM對敏感細胞的IC50為220 ng/mL，對耐藥細胞的IC50為3 100 ng/mL，其耐藥倍數為14.1倍。而flavopiridol對敏感細胞及耐藥細胞的IC50分別為160 nmol/L和185 nmol/L，耐藥倍數僅為1.15倍，其中flavopirdol能有效抑制MG63/ADR細胞增殖（表1）。

2.2 Flavopiridol對骨肉瘤耐藥細胞MG-63/ADR細胞周期的影響

如表2所示，Flavopiridol作用MG63/ADR細胞后，對照組 Sub-G1期為（4.42±0.25）%，實驗組 Sub-G1期比率隨flavopiridol給藥濃度增加而逐漸上升，各實驗組與對照組差異均有統計學意義（P<0.05）。而G0/G1期比率在低濃度（100 nmol/L）給藥時較對照組上升，當濃度上升至200 nmol/L以上時則明顯下降，與對照組比較差異有統計學意義（P<0.05）。

表1 F l a v o p i r i d o l對骨肉瘤耐藥細胞MG 6 3/A D R的抑制率（%）Tab.1 Effect of flavopiridol on proliferation of MG63/ADR cells（%）

表2 F l a v o p i r i d o l給藥后骨肉瘤耐藥細胞MG 6 3/A D R的細胞周期分布（%）Tab.2 Effect of flavopiridol on apoptosis and cell cycle of MG63/ADR cells（%）

2.3 Flavopiridol對耐藥細胞中細胞凋亡蛋白表達的影響

結果顯示，耐藥細胞株中的pro-caspase-9、procaspase-3、Bcl-2以及Bcl-xL的表達下降，活化型caspase-8、PARP-85的表達增加，其效應具有劑量相關性，而p53及Bax的表達無變化（圖1）。

2.4 裸小鼠體內抑瘤實驗結果

在falvopiridol連續給藥5 d后，實驗組和對照組腫瘤體積從第12天起各觀測時點比較差異有統計學意義（P<0.05）。抑瘤率分別為 68.0%（5 mg·kg-1·d-1組）和 89.1%（7.5 mg·kg-1·d-1組），與對照組比較差異有統計學意義（P<0.05）。給藥2周后小鼠體質量各實驗組與對照組差異無統計學意義（P>0.05，表 3）。

3 討論

Flavopiridol作為一種新發現的小分子CDKI，最初來源于一種印度植物的莖皮提取液，其分子量約401.84。既往在針對食道癌、非小細胞肺癌及前列腺癌的抗腫瘤藥物篩選中發現，Flavopiridol可在體內外明顯抑制增殖，其主要機制為通過抑制CDK2及CDK4/6激酶活性，抑制cyclinD1的基因表達，抑制真核細胞轉錄延伸因子P-TEFb的活性，以及下調NO合酶的活性等機制誘導細胞凋亡，相關藥物的應用研究已經進入臨床Ⅱ期實驗，與其他藥物的聯合應用也已進入臨床Ⅲ期實驗，具有較為廣闊的應用前景［6，7］。本實驗所選用的耐阿霉素人骨肉瘤細胞株MG63/ADR細胞是一株典型的MDR細胞系，可以檢測到穩定的P-gp及MRP1高表達，可對ADM及其他多種化學結構及功能完全不同的抗腫瘤藥物產生交叉耐藥［5］。而既往研究表明flavopiridol在結構上存在特異表型，可成為P-gp底物，從而對抗P-gp對多數抗腫瘤藥物所發揮的外排功能，即從結構上天然可對抗P-gp介導的耐藥發生，此外還可作為多藥耐藥另一重要因子——ATP結合盒轉運載體蛋白MPR1的調節劑［8］，對抗由MPR1所導致的多藥耐藥，從而對多藥耐藥細胞有效地發揮其細胞增殖抑制作用。盡管該假說在前列腺癌、肺癌的抗腫瘤耐藥機制中已得以驗證，但CDKI對原發性惡性骨腫瘤耐藥細胞的增殖抑制作用卻鮮見報道。本研究結果表明，flavopiridol可有效抑制骨肉瘤敏感株及耐藥株細胞的增殖，并誘導其凋亡，耐藥株與非耐藥株的IC50濃度相近，提示flavopiridol在應用于骨肉瘤治療時與阿霉素等經典的抗腫瘤藥物不發生交叉耐藥。細胞周期分析及Western blot法檢測凋亡相關蛋白表達實驗的結果進一步表明flavopiridol在高濃度時主要是通過誘導細胞凋亡抑制耐藥骨肉瘤細胞的增殖。裸鼠移植瘤的動物實驗結果也顯示flavopiridol可于體內有效抑制骨肉瘤耐藥細胞的增殖。

表3 F l a v o p i r i d o l對裸鼠移植瘤生長的抑制作用比較（x±s，mm3）Tab.3 Antiproliferative effects of flavopiridol on MG63/ADR cells in vivo（x±s，mm3）

細胞凋亡又稱細胞程序性死亡，迄今為止的研究表明，細胞凋亡的主要通路有線粒體通路、死亡受體通路及內質網通路。細胞凋亡通路在耐藥機制研究中，線粒體凋亡通路的誘導占有十分重要的地位。而在線粒體凋亡通路中，Bcl-2家族成員發揮著至關重要的作用，該家族成員中Bax、PUMA、Noxa、Bid、Bcl-2等相當一部分的因子是p53蛋白信號轉導通路的下游靶基因。Bcl-2是細胞凋亡研究中最受重視的癌基因之一，其抗凋亡Bcl-2家族成員（Bcl-2、BclxL）的過度表達利于細胞的生存，是阻斷細胞凋亡的最后共同通路的關鍵蛋白，與凋亡逃避和化療抗藥性密切相關；而促凋亡Bcl-2家族成員（Bax和Bak）和 BH3 惟一蛋白（Bid、Bim、Bik、PUMA、Noxa）的活性增加則可提高惡性細胞對凋亡的敏感性，從而克服藥物耐受［9］。在p53野生型細胞中，抗腫瘤藥物所導致的Bax/Bcl-2比例的升高是細胞凋亡誘導的常見變化之一。而在本研究中所使用的MG63/ADR細胞為p53突變型細胞株，細胞凋亡相關因子的免疫印跡分析結果表明，flavopiridol給藥后p53及其下游靶因子Bax的表達無變化，而Bcl-2及Bcl-xL的表達被下調，提示其可能通過其他的非p53依賴的線粒體激活路徑發揮了促細胞凋亡的效果［10，11］。caspase是一種門冬氨酸依賴性的半胱氨酸蛋白酶，在細胞凋亡中起著不可替代的重要調控作用。caspase通路是諸多調控通路的關鍵，各凋亡通路最后都有caspase的激活。此外，P-gp還具有抑制細胞caspase依賴性凋亡的作用。細胞的凋亡分為caspase依賴性和非依賴性兩種，P-gp對非依賴性細胞凋亡沒有抑制作用，但P-gp的高表達能抑制由細胞毒藥物、自由基以及放射線等因素引起的caspase依賴性凋亡［12］。曾有研究表明，caspase-3、caspase-8 和caspase-9的激活通路的功能抑制可能是P-gp參與細胞耐藥發生的作用機制之一［13］。本研究結果顯示在耐藥骨肉瘤細胞中導入flavopiridol后，caspase-3、caspase-8及caspase-9的表達可能被再度激活，從而抵消了P-gp對3者的激活抑制作用，進而增強促耐阿霉素骨肉瘤細胞凋亡的效果。

綜上所述，本研究通過體外及體內的聯合實驗確認flavopiridol可明顯抑制人耐阿霉素骨肉瘤細胞株MG63/ADR的增殖，其具體機制可能為通過激活非p53依賴的線粒體信號傳導通路以及誘導MG63/ADR細胞凋亡及激活死亡受體介導的caspase信號傳導途徑。這為未來臨床應用小分子CDKI治療耐藥性的骨肉瘤患者提供了新的有力的實驗室依據。

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