陽離子卟啉對宮頸癌細胞株Caski的光動力學殺傷效應

呂昌帥，丁佰娟，劉洪麗，姜侃，張友忠

（山東大學齊魯醫院婦產科，濟南 2 5 0 0 1 2）

陽離子卟啉（TMPyP4），即四-（N-甲基-4-吡啶基）卟啉，是一類卟啉類衍生物，能夠選擇性地在腫瘤組織中聚集，在正常組織中卻代謝很快，因此長期以來在腫瘤治療、尤其是光動力學治療（photodynamic therapy，PDT）方面備受人們的關注。已有文獻報道，TMPyP4可展開RNA的G-四倍體結構的極端穩定性，并通過中斷G-四倍體鏈調節基因的活性［1］。PDT是一種新興腫瘤治療方法，其利用腫瘤細胞對光敏劑的特異性吸收和潴留，結合特定波長的激光照射，達到選擇性殺傷腫瘤細胞的目的。Ki-67是目前公認的評價細胞增殖狀態的指標。微型染色體維持蛋白（minichromosome maintenance proteins，MCMs）是一組蛋白家族，目前研究已證實其可作為增殖細胞的特異標記［2］。碳酸酐酶Ⅸ（carbonic anhydraseⅨ，CA-Ⅸ）是碳酸酐酶家族異構體之一，參與細胞的增殖和轉化［3］。核因子kappa B（nuclear factor kappa B，NF-κB）是一種具有多向性調節作用的核轉錄因子，與腫瘤的發生發展、腫瘤細胞的浸潤轉移、抗凋亡及耐藥性的產生密切相關［4，5］。多腫瘤抑制基因P16是一種細胞周期調控因子，負調節細胞增殖及分裂［6，7］。目前關于 TMPyP4-PDT作用于宮頸癌細胞株的臨床研究較少，本研究通過觀察TMPyP4-PDT對宮頸癌Caski細胞株細胞凋亡的效應，探討TMPyP4-PDT對腫瘤細胞的殺傷作用及其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

TMPyP4，購自德國Merck公司；RPIM 1640培養基，購自美國GIBCO BRL公司；胎牛血清，購自杭州四季青公司；四甲基偶氮唑藍（MTT），購自Sigma公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒，購自上海貝博生物公司；Trizol試劑，購自Invitrogen公司；RNase、逆轉錄試劑盒及PCR擴增試劑盒，均為東洋紡（上海）生物科技有限公司產品；實時熒光定量PCR所需引物，由上海博尚公司設計并合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：宮頸癌細胞株Caski培養于含有10%胎牛血清的RPIM 1640培養液中，在5%CO2濃度、飽和濕度、37℃孵育箱中培養，3~4 d傳代1次，選取對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 實驗分組：分為正常對照組、單純PDT組、單純TMPyP4組和TMPyP4-PDT組。

1.2.3 MTT法檢測細胞抑制率：將TMPyP4避光保存在4℃冰箱中，用不含胎牛血清的培養基配制成TMPyP4 終濃度分別是 0、3、6、15、30 和 60 μmol/L的孵育液。取對數生長期細胞制成單個細胞懸液，以5×103/孔接種到96孔細胞培養板，每孔加100 μL細胞懸液，在5%CO2濃度、飽和濕度、37℃孵育箱中培養24 h后，在嚴格避光的條件下加入上述濃度的TMPyP4孵育液，孵育4 h后，用波長630 nm、功率800 mW的半導體激光儀垂直照射，能量密度分別是0、2、4和8 J/cm2。照射后所有細胞換成含10%胎牛血清的培養液繼續培養24 h。每孔加入MTT（5 g/L）20 μL，繼續避光培養 4 h，終止培養，小心棄上清，加入200 μL DMSO溶解MTT，輕輕震蕩10 min，在酶聯免疫檢測儀上測定波長為490 nm處各孔的吸光度（A值）。實驗重復3次。計算各組細胞的抑制率，細胞抑制率=1-（實驗組A值/空白組A值）×100%。

1.2.4 形態學觀察：各組細胞處理后繼續孵育24 h，然后在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況和生長形態。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡：選取TMPyP4藥物濃度分別是 3、6、15、30 和 60 μmol/L，激光能量密度4 J/cm2為實驗組。將TMPyP4處理后的各組細胞按照Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒的說明進行雙染，即分別消化離心收集各組細胞，用冷PBS洗3次（1 000 r/min、4℃離心5 min），調整細胞濃度為 1×（105~106）/mL，將細胞懸浮于 200 μL 結合緩沖液中。加入5 μL的Annexin V-FITC染色液，輕輕混勻，于2~8℃避光條件下孵育15 min，然后加入10 μL PI染色液后于2~8℃避光條件下孵育5 min，在1 h內采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.6 實時熒光定量PCR法檢測TMPyP4-PDT對宮頸 癌 Caski 細胞 株 Ki-67、MCM2、P16、CA-Ⅸ 和NF-κBmRNA表達的影響：收集正常對照組和TMPyP4-PDT實驗組細胞，提取總RNA，然后在紫外分光光度儀上測定RNA的濃度。按照逆轉錄試劑盒說明書進行RNA逆轉錄反應合成cDNA，接著進行熒光實時PCR，其10 μL反應體系為：蒸餾水3.2 μL，SYBR Green Realtime PCR Master Mix 5 μL，10 μmol/L的上游引物和下游引物各0.4 μL，模板DNA 1 μL。引物序列見表1。以GAPDH為內參對Ki-67、MCM2、P16、CA-Ⅸ和 NF-κB 進行擴增，采用相對定量法，檢測TMPyP4-PDT作用24 h后上述基因的mRNA水平。三步法PCR擴增條件：95℃預變性30 s，95 ℃ 5 s，58 ℃ 10 s，72℃ 15 s，共 40 個循環。PCR反應完成后進行融解曲線分析，以確定得到的擴增產物是否為單一目的片段。最后由計算機自動計算并導出相對應的閾值循環數。

1.3 統計學分析

應用SPSS 18.0統計學軟件對實驗數據進行統計分析，各組Caski細胞的A值、凋亡細胞百分比及Ki-67、MCM2、P16、CA-Ⅸ和 NF-κBmRNA 的表達水平均以x±s表示，多組間樣本均數的比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2 結果

2.1 A值測定結果

MTT法中，酶聯檢測儀各孔的A值可以間接地反映活細胞數量，在一定范圍內與活細胞的數量成正比。由表2可知：在相同TMPyP4濃度下，隨著激光能量密度的增大A值減小；在相同的激光能量密度照射下，隨著光敏劑濃度的增大A值亦減小；單純PDT組A值變化不明顯。根據細胞抑制率繪制出不同TMPyP4濃度對Caski細胞株的抑制率曲線（圖1）。在相同的激光能量密度條件下，隨著TMPyP4濃度的增加，PDT效應越顯著。單純TMPyP4組對細胞增殖有明顯的抑制作用（P<0.01），且呈劑量依賴性；單純PDT組對細胞增殖的抑制作用不明顯（P>0.05）；TMPyP4-PDT組對細胞增殖的抑制作用隨著藥物作用濃度及激光能量密度的增加而增強（P<0.01）。

表2 MT T檢測不同濃度T MP y P 4和不同激光能量密度對C a s k i細胞A值的影響Tab.2 Different TMPyP4 concentrations and laser energy densities affect A value of Caski cells by MTT

2.2 細胞形態學觀察

空白對照組細胞及單純PDT組細胞呈多角形或梭形貼壁生長，細胞密集，生長狀態良好。單純TMPyP4組細胞隨著藥物濃度的增加，對Caski細胞株的抑制作用逐漸增強，細胞貼壁稀疏，部分細胞變成圓形，出現核固縮、空泡樣改變。TMPyP4-PDT組細胞隨著激光能量密度及藥物濃度的增加，Caski細胞株的抑制作用逐漸增強，貼壁細胞數目明顯減少，出現胞質空泡化、細胞體積縮小、細胞核碎裂及凋亡小體形成等。各組細胞的典型形態學變化見圖2。

2.3 流式細胞儀檢測結果

在激光能量密度為4 J/cm2的條件下，TMPyP4-PDT 組 TMPyP4 濃度為 3、6、15、30 和 60 μmol/L 時細胞凋亡率分別為（5.67±0.35）%、（13.50±0.62）%、（22.83±2.35）%、（34.47±1.88）%和（46.43±1.46）%。隨著藥物濃度的增加，細胞凋亡率逐漸增加，見圖3。

2.4 TMPyP4-PDT 對 Caski細胞 Ki-67、MCM2、P16、CA-Ⅸ和 NF-κBmRNA 表達的影響

在激光能量密度為 4 J/cm2的條件下，3、6、15、30和 60 μmol/L的 TMPyP4作用4 h，Caski細胞 Ki-67、MCM2、CA-Ⅸ和 NF-κBmRNA 表達水平明顯降低，P16mRNA表達水平升高，與正常對照組比較差異均有統計學意義（P<0.01）。以GAPDH為內參照基因，Ki-67、MCM2、P16、CA-Ⅸ和 NF-κBmRNA 的表達水平變化見表3。

表3 各組C a s k i細胞中K i-6 7、MC M2、P 1 6、C A-Ⅸ和N F-κBmR N A表達變化Tab.3 Changes of expressions of Ki-67，MCM2，P16，CA-Ⅸ and NF-κB mRNA in Caski cells in various groups

3 討論

腫瘤的PDT是繼傳統手術和放化療之后，正在興起的一種治療腫瘤的新型醫療技術。這種治療方法是基于將光敏劑選擇性地富集在腫瘤細胞里，然后用一定波長的光激發產生單態氧直接損傷腫瘤細胞并在過氧化反應中產生丙二醛，其凋亡途徑可能不依賴caspase-3［8］。與傳統的治療方法相比，PDT最大的優點是對腫瘤組織選擇性殺傷效率高、毒副作用較小、收效快、重復應用不產生耐藥性、在殺死腫瘤細胞的同時不危及正常組織細胞等。光敏劑是光動力治療的關鍵［9，10］。TMPyP4 是水溶性陽離子卟啉衍生物，與正常的組織相比，可以在腫瘤組織中蓄積達到較高的濃度。有研究推測卟啉可與G-四分體結合，形成穩定的G-四聯體結構，并且可以下調cmyc和hTERT基因的表達，抑制端粒酶的活性［11］，將其作用于腫瘤細胞可抑制腫瘤細胞生長，誘導腫瘤細胞凋亡。

有研究報道，Ki-67、MCM2、CA-Ⅸ和 NF-κB 等基因與細胞的增殖和轉化有關，能夠反映細胞增殖狀態，有助于預測腫瘤復發風險［12~14］。P16基因是繼P53、Rb抑癌基因之后被發現的又一引人注目的新的抑癌基因，也是人們發現的第一個直接作用于細胞周期的抑癌基因。P16是多腫瘤抑制基因，抑制細胞從G1期向S期轉換，在細胞分化周期水平上參與細胞凋亡的發生［15，16］。

本研究MTT結果顯示，A值隨著TMPyP4濃度和照光劑量的增加而降低，單純照光組A值變化不明顯。TMPyP4-PDT對Caski細胞有明顯的抑制作用，且其作用呈劑量依賴性。TMPyP4-PDT作用于宮頸癌Caski細胞后，細胞形態發生明顯變化，倒置顯微鏡下可見胞質空泡化、細胞體積縮小、細胞核碎裂及凋亡小體形成等凋亡特征性變化。從組織形態學以及流式細胞凋亡檢測分析看，PDT可顯著誘導宮頸癌Caski細胞凋亡。

本研究實時熒光定量PCR結果顯示，TMPyP4-PDT處理后的宮頸癌Caski細胞中Ki-67、MCM2、CA-Ⅸ和NF-κBmRNA表達水平顯著低于對照組（P<0.05），表明TMPyP4-PDT光動力作用可以負性調節宮頸癌 Caski細胞 Ki-67、MCM2、CA-Ⅸ和 NF-κB的表達水平。而經TMPyP4-PDT處理后的Caski細胞中P16mRNA表達水平高于對照組（P＜0.05），提示TMPyP4-PDT光動力作用激活了P16基因功能，促使腫瘤細胞凋亡及壞死。根據這一結果推測TMPyP4-PDT作用于腫瘤細胞一段時間后，通過正性調節 P16以及負性調節 Ki-67、MCM2、CA-Ⅸ和NF-κB的表達從而抑制腫瘤細胞的增殖和轉移。

［1］Morris MJ，Wingate KL，Silwal J，et al.The porphyrin TMPyP4 unfolds the extremely stable G-quadruplex in MT3-MMP mRNA and alleviates its repressive effect to enhance translation in eukaryotic cells［J］.Nucleic Acids Res，2012，40（9）：4137-4145.

［2］ Suzuki S，Kurata M，Abe S，et al.Overexpression of MCM2 in myelodysplastic syndromes：association with bone marrow cell apoptosis and peripheral cytopenia［J］.Exp Mol Pathol，2012，92（1）：160-166.

［3］Simi L，Venturini G，Malentacchi F，et al.Quantitative analysis of carbonic anhydraseⅨmRNA in human non-small cell lung cancer［J］.Lung Cancer，2006，52（1）：59-66.

［4］Maldonado ME，Bousserouel S，Gosse F，et al.Implication of NF-kappa B and p53 in the expression of TRAIL-death receptors and apoptosis by apple procyanidins in human metastatic SW620 cells［J］.Biomedica，2010，30（4）：577-586.

［5］周巧直，陸三軍，王星，等.核因子Kappa B途徑在煙草提取物促食管鱗狀細胞癌細胞增生中的作用［J］.首都醫科大學學報，2010，31（3）：329-334.

［6］Krakowczyk L，Strzelczyk JK，Adamek B，et al.Methylation of the MGMT and p16 genes in sporadic colorectal carcinoma and corresponding normal colonic mucosa［J］.Med Sci Monit，2008，14（10）：BR219-BR225.

［7］Krakowczyk L，Blamek S，Strzelczyk JK，et al.Effects of X-ray irradiation on methylation levels of p16，MGMT and APC genes in sporadic colorectal carcinoma and corresponding normal colonic mucosa［J］.Med Sci Monit，2010，16（10）：CR469-CR474.

［8］陳曉華，羅榮成，李黎波，等.人食管癌荷瘤裸鼠光動力效應機制的初步研究［J］.南方醫科大學學報，2009，29（11）：2222-2224.

［9］Juarranz A，Jaen P，Sanz-Rodriguez F，et al.Photodynamic therapy of cancer.Basic principles and applications ［J］.Clin Transl Oncol，2008，10（3）：148-154.

［10］Josefsen LB，Boyle RW.Photodynamic therapy and the development of metal-based photosensitisers［J］.Met Based Drugs，2008，2008（1）：276109-276132.

［11］Guo K，Pourpak A，Beetz-Rogers K，et al.Formation of pseudosymmetrical G-quadruplex and i-motif structures in the proximal promoter region of the RET oncogene［J］.J Am Chem Soc，2007，129（33）：10220-10228.

［12］Saydam O，Senol O，Schaaij-Visser TB，et al.Comparative protein profiling reveals minichromosome maintenance（MCM）proteins as novel potential tumor markers for meningiomas［J］.J Proteome Res，2010，9（1）：485-494.

［13］Hernandez-Flores G，Ortiz-Lazareno PC，Lerma-Diaz JM，et al.Pentoxifylline sensitizes human cervical tumor cells to cisplatininduced apoptosis by suppressing NF-kappa B and decreased cell senescence［J］.BMC Cancer，2011，11（1）：483-497.

［14］Airley R，Loncaster J，Davidson S，et al.Glucose transporter glut-1 expression correlates with tumor hypoxia and predicts metastasisfree survival in advanced carcinoma of the cervix［J］.Clin Cancer Res，2001，7（4）：928-934.

［15］Nobori T，Miura K，Wu DJ，et al.Deletions of the cyclin-dependent kinase-4inhibitorgeneinmultiplehumancancers［J］.Nature，1994，368（6473）：753-756.

［16］Kamb A，Gruis NA，Weaver-Feldhaus J，et al.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types［J］.Science，1994，264（5157）：436-440.