新基因JDP2通過不同通路抑制人胰腺癌上皮向間質轉化作用的研究

許元鴻，劉哲，郭克建，杜瑞霞，蔣紅軍

（1.中國醫科大學附屬第一醫院胰腺外科，沈陽 1 1 0 0 0 1；2.沈陽醫學院附屬奉天醫院耳鼻咽喉科，沈陽 1 1 0 0 2 4；3.沈陽醫學院附屬奉天醫院 放射線科，沈陽 1 1 0 0 2 4）

在美國，胰腺癌在各種癌癥死因中列第四位。其早期診斷困難，對化療及其他療法相對不敏感，5年生存率僅為3%~5%［1］。進一步解析胰腺癌發生、發展的分子機制，對胰腺癌的診斷和治療將產生深遠的影響。

Jun二聚化蛋白2（Jun dimerization protein 2，JDP2），是以轉錄活化因子蛋白1（activator protein-1，AP-1）成員之一的c-Jun的結合蛋白被分離出來［2］，由163個氨基酸組成，并含有一個亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper，bZIP）結構。在53例取自7種不同類型惡性腫瘤的標本中，JDP2的表達水平在35.8%的癌組織標本中呈不同程度的下降，而只有在5.8%的樣品顯示相反的結果［3］。目前越來越多的研究證明JDP2是一種新的抑癌因子。其可以通過多種途徑抑制惡性腫瘤早期的侵襲和轉移。

上皮向間質轉化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）自20余年前被提出以來，一直受到廣泛的關注。經典的誘導EMT的因子為TGF-β，另外還有表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）等。EMT使細胞失去極性，丟失細胞間緊密連接和黏附連接，獲得了浸潤性和游走遷移能力。目前已經在乳腺癌、口腔鱗癌、肝癌、胰腺癌等多種癌癥中得到證明［4~7］。

在本研究中，我們通過轉染JDP2后的胰腺癌細胞系BxPC3可以抑制由collagen I及TGF-β1誘導形成的EMT。以此證明，作為抑癌因子的JDP2可以通過多種途徑對于胰腺癌的EMT起到抑制作用，這種抑制作用，極可能成為新的研究胰腺癌的靶點和方向。由此我們推測JDP2可能通過多種途徑對EMT起到抑制作用。

1 材料與方法

1.1 抗體和生長因子

兔抗羊E-cadherin、vimentin單克隆抗體及兔抗羊JDP2多克隆抗體購自Santa Cruz公司；TGF-β1購自Repro tech公司；Collagen I購自Sigma公司。

1.2 細胞培養及轉染

人胰腺癌細胞株BxPC3購自上海中科院細胞庫。培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于37℃，5%CO2培養箱中，2 d換液1次，3~4 d傳代1次。表達JDP2質粒pCEFL-HA-JDP2由以色列Ami Aroheim教授饋贈（The Rappaport Family Institute for Research in the Medical Sciences，Technion-Israel Institute of Technology，Israel）。當細胞在 6 孔板上培養達到70%~80%融合時，用lipofectamine 2000將pCEFL-HA-JDP2或pCEFL-質粒按照說明書瞬時轉染至BxPC3細胞中，48 h后，轉染pCEFL-HAJDP2及pCEFL-質粒的BxPC3細胞酶消化法傳代至已鋪好collagen I的6孔板中，另一組在已轉染pCEFL-HA-JDP2及pCEFL-質粒的BxPC3細胞中加入 TGF-β1（10 ng/mL）誘導 7 d；倒置相差顯微鏡觀察細胞形態變化。

1.3 Western blot檢測

Western blot蛋白印跡檢測 JDP2、E-cadherin、Vimentin表達：嚴格按照RIPA蛋白裂解液試劑盒說明書進行各組蛋白的提取，將蛋白與5×蛋白上樣緩沖液以4∶1混合后煮沸變性5 min，置于10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，分離的蛋白轉移至PVDF膜上之后，用5%脫脂奶粉配置的TBST室溫封閉 2 h，加入 JDP2（1∶600）、E-cadherin（1∶800）、vimentin（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 500）一抗后4℃封閉過夜，辣根過氧化物酶標記的二抗室溫2 h，TBST 洗膜，5 min×4 次，化學發光法（electrochemiluminescence，ECL）顯色。實驗重復3次。1.4 Transwell小室侵襲實驗

Transwell小室上室鋪 50 μL（100mg/L）Matrigel生物膠，下室中加入含15%胎牛血清的DMEM培養基600 μL。所有實驗細胞均調整密度為2×105/孔，種于小室上室。放于培養箱中培養24 h。取出PBS沖洗后，4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色，200倍顯微鏡下計數，任意選取5個視野，以其平均細胞數為侵襲至膜上的細胞數，每組重復3次實驗，求取平均數為結果。

1.5 免疫熒光觀察

所有細胞均用PBS沖洗3次，然后用4%多聚甲醛室溫固定30 min，5%BSA室溫封閉1 h，之后用E-cadherin、vimentin相應一抗4℃孵育過夜。PBS沖洗3次后，用FITC-或TRITC-標記的二抗室溫孵育30 min。熒光顯微鏡下觀察熒光信號。

1.6 統計學處理

所有計量資料均采用x±s表示。采用SPSS13.0軟件對結果進行分析，應用t檢驗統計分析；P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 轉染JDP2可以抑制細胞形態學的轉變

與空白對照組相比，僅僅轉染空白質粒的Bx－PC3細胞在Collagen I誘導48 h或TGF-β1誘導7 d后形態學發生明顯改變，大多數細胞變成梭形，細胞和細胞間緊密連接喪失（圖1C、F）。經轉染JDP2的BxPC3細胞再被Collagen I誘導48 h或TGF-β1誘導7 d后，僅少量細胞變成梭形，細胞間緊密連接喪失不明顯（圖1B、E）。接下來分別將空白對照組、轉染空質粒并用Collagen I誘導、轉染JDP2并用Collagen I誘導、轉染空質粒并用TGF-β1誘導、轉染JDP2 并用 TGF-β1 誘導簡稱為：B、B-V-C、B-J-C、BV-T、B-J-T。

2.2 相比B-J-C與B-J-T細胞，B-V-C與B-V-T細胞vimentin表達上調，細胞侵襲能力增加

為了驗證轉染JDP2的BxPC3細胞是否能夠改變EMT相關標志物的表達，應用Western blot檢測vimentin、E-cadherin蛋白表達。結果證明與空白對照組相比，B-J-C及B-J-T細胞E-cadherin、vimentin表達變化均不顯著（圖2b，圖3b）；B-V-C及B-V-T細胞vimentin蛋白表達升高，E-cadherin蛋白表達降低（圖2b，圖3b）；我們同時應用免疫熒光驗證vimentin、E-cadherin的表達，結果證明B-V-C及BV-T細胞vimentin表達升高（圖2a，圖3a）而E-cadherin的表達明顯降低（圖2a，圖3a）。細胞侵襲能力檢測證明B-J-C及B-J-T組細胞侵襲能力亦明顯小于B-V-C 及 B-V-T組細胞（P＜0.05）（圖2c，圖 3c）。以上均證明，JDP2高表達細胞能夠明顯抑制由Collagen I及TGF-β1誘導產生的EMT。

3 討論

胰腺癌是一種發病隱匿、進展迅速、治療效果及預后極差的消化道惡性腫瘤，其5年生存率僅為3%~5%［8］，轉移是胰腺癌患者的主要死因。聯合放化療雖然可以改善生存率［11］，但是由于早期出現的微轉移及無特異癥狀等原因造成其預后極差。EMT和包括胰腺癌在內的腫瘤的侵襲、轉移密切相關［7，9，10］。最新在《Cell》上發表的研究結果表明，老鼠胰腺癌模型的胰腺細胞在PanIN（pancreatic intraepithelial neoplasia）期就已發生EMT，上皮間質化的細胞具有高侵襲和轉移能力［12］。因此，研究胰腺癌EMT的分子機制將對我們發現控制胰腺癌轉移的方法從而提高胰腺癌患者的生存率具有重要意義。

轉錄因子JDP2是AP-1類的抑制因子之一，而AP-1是由Jun、Fos或ATF等家族成員構成的異源二聚體，其功能涉及細胞周期調節，細胞分化，凋亡及腫瘤的發生等方面。作為含有堿性亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper，bZIP）結構的DNA結合蛋白，JDP2可與自身或者與 c-Jun、JunB、JunD或ATF-2等形成二聚體，抑制c-Jun、c-Fos、ATF-2和cyclin-A2等癌相關基因的轉錄活性，提示JDP2是一種廣泛的 AP-1 抑制因子［2，13，14］。除轉錄抑制活性外，JDP2可與孕酮受體（progesterone receptor，PR）結合增加PR介導的轉錄活性［15］，還可與CHOP10結合促進 TRE（TPA response element）依賴性轉錄［16］。這些結果說明JDP2具有抑制和促進轉錄的雙重功能，因此，對腫瘤的作用也可能具有雙重性。Heinrich等發現JDP2可抑制Ras誘導的NIH3T3細胞的轉化，并可抑制前列腺癌細胞的增殖和荷瘤鼠瘤的形成，而且在7種不同類型惡性腫瘤中，JDP2的表達水平呈不同程度下降，提示JDP2具有抑癌作用［3］。然而有學者通過病毒插入突變技術在鼠淋巴瘤模型中篩查出若干候選癌基因，其中包括 JDP2［17，18，19］。另外在肝癌轉基因鼠模型中，JDP2過表達顯著提高死亡率，增大腫瘤的體積，提示JDP2也有促進腫瘤生長的作用［20］。因此，在不同腫瘤中JDP2的表達可能升高或下調，并通過與不同信號轉導通路的轉錄因子結合發揮不同的作用，但其在腫瘤過程中被調控以及作用機制尚不清楚，需進一步探討。

在本實驗中，我們首先應用Collagen I或TGF-β1誘導已經轉染pCEFL-HA-JDP2或pCEFL-空質粒的胰腺癌細胞系BxPC3。我們發現，與空白對照組相比，空白質粒組細胞明顯變成長梭形，細胞間緊密連接喪失，vimentin蛋白表達水平顯著升高；而細胞免疫熒光檢測中，E-cadherin的蛋白表達水平顯著下調，同時細胞的transwell侵襲實驗顯示其侵襲能力顯著增高。這些變化在轉染JDP2組的BxPC3細胞中卻并不明顯。說明轉染JDP2后的BxPC3細胞能夠抑制由Collagen I或TGF-β1誘導產生的EMT。TGF-β與其受體結合后，激活細胞內Smad信號通路，通過抑制E-cadherin的表達來誘導EMT發生［21，22］。在人的角質細胞中，由 TGF-β 誘導產生的EMT需要Ras基因的激活［23］。而在人胰腺癌中，Collagen I通過激活JNK1而使得胰腺癌的N-cadherin表達上調從而增加其侵襲能力［24］。這些都提示，JDP2抑制胰腺癌EMT的機制很可能通過抑制AP-1來阻斷Ras或JNK信號傳導途徑，但是其確切機制目前研究仍是空白。

綜上所述，我們在本實驗中發現，轉染JDP2后的BxPC3胰腺癌細胞能夠抑制Collagen I或TGF-β1誘導產生的EMT。由此可見，JDP2可通過不同的通路與胰腺癌的侵襲、轉移密切相關，作為一種抑癌因子，將為胰腺癌的分子靶向治療提供新的方向。

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