卵泡中肝素結合表皮生長因子樣生長因子的表達及其與卵泡發育的關系

潘伯臣，馮翼飛，葉瑩心

（中國醫科大學附屬盛京醫院婦產科輔助生殖中心，沈陽 1 1 0 0 0 4）

卵泡發育是一個以形態變化為特征的生長過程，同時伴隨著卵泡功能的分化。這種發育與分化過程是在垂體分泌的促性腺激素、性激素以及卵巢的局部細胞因子的協同作用下完成的。其中，卵巢局部因子如生長因子的作用是不可或缺的，因此也成為近年來卵巢生殖生理研究的熱點問題。肝素結合表皮生長因子樣生長因子（heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor，HB-EGF）是表皮生長因子家族中新的成員，因與肝素有很強的結合力而得名。HB-EGF有2種存在形式：溶解型HBEGF（soluble HB-EGF，sHB-EGF）和膜結合型HBEGF（proHB-EGF），后者是溶解型（也稱為分泌型）的前體。sHB-EGF是多種細胞的分裂原，而proHBEGF的生物學效應則主要表現為抑制細胞生長等［1］。

我們先前的研究發現，不孕女性患者在接受體外受精—胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）的超促排卵過程中，獲得的黃素化顆粒細胞在體外培養條件下表達HB-EGF及其特異受體，提示了HB-EGF可能在卵泡發育及分化中發揮一定的作用［2，3］。但是，在體情況下卵泡中是否存在HB-EGF表達，尚未見報道。本研究檢測IVF-ET超促排卵過程中生成的黃素化卵泡中HB-EGF的表達，并探討sHB-EGF和proHB-EGF與卵泡發育的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器和試劑：HB-EGF抗體（美國Santa Cruz公司），高速冷凍離心機（3C15K，美國Sigma公司），多功能電泳儀（北京六一儀器廠），722可見光分光光度計（上海精密科學儀器有限公司），凝膠自動成像及分析系統（ChemiImager 5500，美國Alpha公司）。

1.1.2 實驗材料：選擇在我院輔助生殖中心接受IVF-ET治療的患者42例，年齡25~37歲。取卵時，在同一患者同時獲取大卵泡與小卵泡的卵泡液。其中17例患者同時分離、獲取了黃素化顆粒細胞，用于實驗及數據分析。

1.2 方法

1.2.1 超促排卵：取卵前常規給予患者刺激卵泡發育治療，包括使用促性腺激素釋放激素激動劑（達菲林或抑那通）降調垂體敏感性和使用人絕經期促性腺激素（麗申寶或果納芬）刺激卵泡發育。當最大卵泡長至大于18 mm時，給予人體絨膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）5 000~10 000 IU促進卵泡進成熟。hCG注射后36 h取卵。

1.2.2 卵泡液及顆粒細胞的采集：按我院常規經陰道B超引導下取卵，記錄卵泡直徑大小，直徑>16 mm定義為大卵泡（成熟卵泡），卵泡直徑<14 mm定義為小卵泡（未成熟卵泡）。取卵日根據需要每側卵巢各取第1個卵泡（大或小卵泡）。卵泡液以1 500 r/min離心10 min，取上清-20℃冰箱保存待測。然后將細胞沉淀物置于60%細胞分離液Percoll表層，4℃、1 200 r/min離心15 min以去除紅細胞，收集中間相細胞，PBS洗凈后取少許細胞置于顯微鏡下觀察，確認為顆粒細胞后，將顆粒細胞置于-20℃冰箱保存待測。

1.2.3 Western blot測定卵泡液中sHB-EGF蛋白：卵泡液中蛋白定量采用考馬斯亮藍法，按試劑盒說明操作。蛋白變性處理后經12%SDS-PAGE電泳2 h，轉印至硝酸纖維素膜，用含5%去脂奶粉的TTBS封閉4℃過夜，加一抗（1∶400）室溫下孵育2 h，加堿性磷酸酶標記的二抗（1∶2 000），室溫下孵育2 h，清洗后酶法顯色。結果量化分析使用FlourChem V 2.0凝膠成像分析軟件（美國Alpha公司），記錄每條蛋白電泳帶的灰度值，進行定量分析。

1.2.4 Western blot測定顆粒細胞中proHB-EGF蛋白：（1）蛋白的提取：取出液氮中凍存的標本，加入RIPA裂解液作用30 min，經超聲粉碎后，10 000 r/min離心30 min，吸取上清備用。（2）其余步驟同卵泡液中sHB-EGF蛋白的測定。

1.3 統計學分析

采用SPSS 11.5軟件包進行統計學分析。計量資料以x±s表示，組間比較采用配對t檢驗，計數資料的組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

42例患者穿刺的42個大卵泡中有2個（4.76%）為空卵泡，42個小卵泡中有9個（21.43%）空卵泡，大小卵泡比較，空卵泡比例差異有統計學意義（P<0.05）。

42例患者中，有17例患者可以同時分離到大、小卵泡的卵泡液和顆粒細胞；這部分患者的材料用于HB-EGF的檢測和分析。結果發現，大卵泡與小卵泡的卵泡液中sHB-EGF蛋白全部呈陽性表達；同樣，所有顆粒細胞中均檢測到proHB-EGF的蛋白表達，見圖1。

大卵泡和小卵泡卵泡液中sHB-EGF蛋白表達量分別為288.37±15.44和172.06±22.28，大卵泡和小卵泡顆粒細胞中proHB-EGF蛋白表達量分別為76.32±10.05和 28.50±6.20。同一卵泡中，卵泡液中sHB-EGF含量明顯大于顆粒細胞中proHB-EGF表達量，差異有統計學意義（P<0.05）。大、小卵泡比較，大卵泡液中sHB-EGF含量明顯大于小卵泡，差異有統計學意義（P<0.05）；同樣，大卵泡中顆粒細胞的proHB-EGF表達量明顯高于小卵泡，差異有統計學意義（P<0.05）；但小卵泡中sHB-EGF平均含量與proHB-EGF平均含量的比值（6.04）明顯高于大卵泡（3.78）。此外，2個大的空卵泡中sHB-EGF含量分別為76.78和89.86。

3 討論

原始卵泡一旦啟動生長，便是一個連續不斷的發育和分化過程，要么變成優勢卵泡，成熟與排放，要么中途細胞凋亡形成閉鎖卵泡。通常以為卵泡是由垂體促卵泡生長激素（follicle-stimulating hormone，FSH）調控的，因為卵泡顆粒細胞中存在FSH受體，而且臨床上也發現女性基礎FSH水平與卵巢儲備功能有關［4］，但許多生長因子參與了卵泡的發育及分化過程。例如，轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）可以促進FSH受體的表達，放大FSH誘導的芳香化酶活化、黃體酮生成及黃體生成素（luteinizing hormone，LH）受體產生的生理過程［5］。IVF-ET超促排卵過程中，通常使用超生理劑量的FSH促使卵泡產生大量卵泡，繼而使用hCG（LH）進一步促使生長的卵泡成熟與分化，以便獲取更多的成熟卵子用于體外受精和胚胎移植，提高接受IVF-ET治療患者的妊娠率。有報道指出，卵巢局部因子特別是生長因子同樣也介導了FSH/LH（hCG）對卵泡的刺激作用。例如，血管內皮生長因子被認為是IVF-ET過程中產生卵巢過度刺激綜合征的主要介導因子［6］。但IVF-ET超促排卵過程中產生的卵泡中是否存在HB-EGF，以及HB-EGF是否參與了卵泡的發育與分化，至今尚未見報道。此外，HB-EGF蛋白的2種存在形式即sHB-EGF和pro－HB-EGF，它們在卵泡中的分布如何以及它們與卵泡發育和分化的關系也不十分清楚。

我們在先前的動物試驗中發現，大鼠卵巢中HB-EGFmRNA表達量在大鼠發情前期的上午（相當于卵泡生長期）明顯高于發情前期的晚上（此時卵巢中存在大量排卵前的成熟卵泡）；與此同時，大多數的初級卵泡和全部次級卵泡的顆粒細胞中存在proHB-EGF的蛋白表達，但成熟卵泡的顆粒細胞中卻不存在proHB-EGF的表達；而且，閉鎖卵泡中正在凋亡的顆粒細胞也表達proHB-EGF。類似的現象同樣存在于未成年大鼠假孕模型中：經PMSG刺激卵泡生長后，小卵泡及閉鎖卵泡中存在proHB-EGF蛋白表達，而大卵泡中則不存在［7］。這種現象提示，在卵泡發育的相對早期階段，HB-EGF的表達可能主要是為了卵泡的生長發育，而到卵泡發育晚期接近成熟階段，HB-EGF新的合成及分泌需要關閉，以利于卵泡的分化成熟。為了進一步研究HB-EGF與人卵泡發育與分化的關系，特別是了解HB-EGF是否參與了IVF-ET中FSH/LH促超排卵過程，我們在先前的研究中對體外培養的人黃素化顆粒細胞進行了檢測，發現該細胞中存在HB-EGF及其特異受體的表達［2，3］。本研究在這些前期研究的基礎上，進一步探討HB-EGF是否存在于在體的卵泡中，以及HB-EGF與IVF-ET超促排卵中卵泡的發育與分化是否有關。結果發現，所有檢測的卵泡中均存在HBEGF的表達。而且，大卵泡中無論是卵泡液中的sHB-EGF還是顆粒細胞的proHB-EGF，其含量均明顯高于小卵泡，提示HB-EGF參與了卵泡發育和成熟的過程。進而卵泡中HB-EGF的2種存在形式以sHB-EGF為主，提示在卵泡的發育及分化過程中sHB-EGF發揮了主要作用。本研究的另一個重要發現是，小卵泡中sHB-EGF與proHB-EGF的比值明顯高于大卵泡。小卵泡與大卵泡的不同之處在于小卵泡處于卵泡發育的相對早期階段，主要生理現象是細胞增殖、卵泡生長，而大卵泡則處于卵泡發育的較晚階段，主要是細胞的分化與成熟，為卵子的成熟與排出構建適宜的環境。因此，相對于大卵泡而言，小卵泡可能更需要生長因子來維系細胞的增殖和卵泡的生長。從目前HB-EGF相關的研究結果看，sHB-EGF對絕大多數的細胞具有促增殖作用，而proHB-EGF的作用多為介導細胞形態學變化、抑制細胞生長等［1，8，9］。因此，本研究中小卵泡 sHB-EGF與proHB-EGF比值高于大卵泡的實驗結果，從一個側面反映了小卵泡比大卵泡更具有生長潛能的現象，與上述的動物實驗觀察到的現象一致。而且，從卵泡中卵子的回收情況看，大卵泡的卵子回收率明顯高于小卵泡；同時，2個大的空卵泡中sHB-EGF濃度遠低于含有卵子的大卵泡中sHB-EGF濃度。這一結果似乎也提示了sHB-EGF對卵子發育的重要性，但仍需加大樣本量進一步探討。

［1］Higashiyama S.Metalloproteinase-mediated shedding of heparinbinding EGF-like growth factor and its pathophysiological roles［J］.Protein Pept Lett，2004，11（5）：443-450.

［2］潘伯臣，葉瑩心，王秀霞，等.人黃素化顆粒細胞中EGF受體家族的表達［J］.中國醫科大學學報，2007，36（2）：183-184.

［3］潘伯臣，葉瑩心，王秀霞，等.肝素結合表皮生長因子在人黃素化顆粒細胞中的表達［J］. 中國醫科大學學報，2007，36（5）：594-597.

［4］陳士嶺，羅燕群，夏容，等.年輕婦女基礎FSH高水平與卵子和胚胎的數量、質量及臨床結局的關系［J］.南方醫科大學學報，2011，31（5）：777-781.

［5］Knight PG，Glister C.TGF-beta superfamily members and ovarian follicle development［J］.Reproduction，2006，132（2）：191-206.

［6］Gómez R，Soares SR，Busso C，et al.Physiology and pathology of ovarian hyperstimulation syndrome［J］.Semin Reprod Med，2010，28（6）：448-457.

［7］Pan B，Sengoku K，Takuma N，et al.Differential expression of heparinbinding epidermal growth factor-like growth factor in the rat ovary［J］.Mol Cell Endocrinol，2004，214（1-2）：1-8.

［8］TakemuraT，Hino S，Okada M，et al.Role of membrane-bound heparinbinding epidermal growth factor-like growth factor（HB-EGF）in renal epithelial cell branching［J］.Kidney Int，2002，61 （6）：1968-1979.

［9］Uetani T，Nakayama H，Okayama H，et al.Insufficiency of pro-heparinbinding epidermal growth factor-like growth factor shedding enhances hypoxic cell death in H9c2 cardiomyoblasts via the activation of caspase-3 and c-Jun N-terminal kinase［J］.J Biol Chem，2009，284（18）：12399-12409.