肝細胞生長因子基因修飾骨髓間充質干細胞

具星愛 劉滋康 郭子寬 李占全

(1.遼寧省人民醫院 沈陽 110016; 2.安徽醫科大學第三附屬醫院院士工作站 合肥 230000;3. 軍事醫學科學院 北京 100850)

人骨髓間充質干細胞(hMSC)是一種成體干細胞,可誘導分化軟骨、骨骼、脂肪等多種組織,并且分泌多種細胞因子及生長因子,如內皮細胞生長因子、表皮生長因子、白介素-4、白介素-10等,具有免疫調節功能。鑒于此,hMSC已被用于多種疾病的治療。肝細胞生長因子(HGF)是一種具有多種功能的細胞因子,可以促進血管新生、肝臟修復、抑制細胞凋亡,還可以趨化外周血干細胞遷徙至組織修復部位。本研究針對hMSC用腺病毒介導的基因修飾HGF,并對其進行鑒定。

1 方法

1.1 骨髓hMSC的原代分離培養以及Ad-HGF轉染

取肝素抗凝的正常人骨髓5mL,用密度梯度離心法收獲單個核細胞層,按照2.0×105cells/cm2的密度接種細胞培養皿,以含10%FBS的α-MEM進行培養。當細胞生長匯合率為80%～90%時,消化并傳代。培養hMSC至第三代,生長匯合率達到70%～80%,在無血清培養體系中按照感染復數MOI=150pfu/細胞加入重組Ad-HGF的腺病毒顆粒。首先吸去培養上清,PBS洗滌培養瓶底面2遍后加入含Ad-HGF腺病毒顆粒的無血清α-MEM,體積為原先培養體積的一半。37℃,5%CO2和飽和濕度條件下孵育2h,加入相同體積的MSC完全培養基,使FBS的終濃度達到10%。繼續培養48h,收獲的細胞即為hMSC/Ad-HGF。按上述同樣方法,攜帶GFP基因的腺病毒載體(Ad-GFP)轉染hMSC作為對照。

1.2 hMSC/Ad-HGF的鑒定

圖1 hMSC/Ad-HGF表面標志物的鑒定

1.2.1 轉染前后細胞形態的鑒定 我們采用瑞士吉姆薩染色方法,對hMSC、hMSC/Ad-HGF進行光學顯微鏡下觀察細胞的形態,轉染Ad-GFP的hMSC形態則在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.2 轉染前后細胞表型的鑒定 第三代對數生長期的hMSC/Ad-HGF,用0.1%胰蛋白酶消化后計數,每2.0×105個細胞分別與FITC或PE標記的小鼠抗人CD31-PE,CD45-PE,CD34-PE,CD29-PE,CD14-PE,CD44-PE單克隆抗體避光孵育30min,流式細胞儀檢測,WinMDI 2.9軟件進行分析。

1.2.3 培養上清HGF濃度的鑒定 利用ELISA方法,以hMSC和hMSC/Ad-GFP作為對照,對hMSC/Ad-HGF培養上清的HGF濃度進行測定。將3組細胞均換成無血清α-MEM后繼續培養24h,收集細胞培養上清,抗原包被,HGF標準品濃度梯度(ng/mL):200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、0,同時設空白調零孔,每稀釋度作5復孔,100μL/孔,4℃過夜。24h后,棄包被液,用1%BSA溶液封閉過夜,加入HGF抗體,100μL/孔,用封口膜封住反應孔,37℃孵育60min。棄一抗,用加入二抗,每空100uL,37°孵育45min。用含0.05%Tween-20的PBS洗去未結合的抗體,3×5min;用OPDH2O2系統顯色,490nm波長測定光密度值。

1.3 統計學分析

數據以平均數±標準差表示,以t檢驗進行統計學處理,P<0.05為顯著性差異。

2 結果

2.1 轉染前后hMSC的形態學鑒定

光鏡下觀察形態結果,hMSC轉染前后均為成纖維樣細胞形態,但是轉染后的細胞增殖較快,細胞數量明顯增加,說明轉染肝細胞生長因子不會導致骨髓間充質干細胞形態的改變,同時也可說明轉染肝細胞生長因子不會阻礙骨髓間充質干細胞的增殖。通過熒光顯微鏡觀察,腺病毒感染后24h可見綠色熒光表達,說明腺病毒能夠有效感染原代MSC細胞,可以作為MSC基因治療的載體。

2.2 轉染前后細胞表型的鑒定

經過基因修飾的hMSC是否表達原來的表型？本實驗應用流式細胞儀檢測了細胞表型。如圖1所示,hMSC/Ad-HGF大小和顆粒度相對均一,表達間充質干細胞特異性表面抗原分子CD44和CD29,而不表達造血細胞及內皮細胞的標志物CD34,CD45,CD14和CD31,與hMSC的細胞表型完全一致。這說明轉染Ad-HGF后hMSC細胞表面標志物并沒有改變。

2.3 hMSC/Ad-HGF培養上清HGF濃度的鑒定

hMSC基因修飾Ad-HGF48h后,ELISA方法檢測HGF表達水平。結果hMSC/Ad-HGF的培養上清中HGF濃度達到(80.6±4.6)ng/mL,接近于對照組3.8倍。hMSC/Ad-HGF培養上清中HGF濃度顯著高于hMSC和hMSC/Ad-GFP組(P<0.001),而后兩者之間的HGF培養上清HGF濃度無顯著性差異。

3 討論

上世紀60年代Friedenstein A J等發現,骨髓間充質干細胞在體外貼壁培養形成集落,并在不同條件下可誘導分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、基質細胞、成纖維細胞和肌腱細胞、心肌樣細胞等,具備多向分化潛能。MSCs具有廣泛的應用價值。

大鼠肝臟再生過程中,血漿內存在一種與損傷肝臟的修復密切相關的蛋白質組分,稱為肝細胞生長因子,HGF是目前進入臨床試驗階段促血管形成細胞因子之一,可以促進血管新生、肝臟修復、抑制細胞凋亡、還可以趨化外周血干細胞遷徙至組織修復部位。

本實驗原代培養人骨髓間充質干細胞后轉染Ad-HGF,首先從形態學證實Ad-HGF轉染不會導致骨髓間充質干細胞發生形態學的變化,不會阻礙hMSC的體外增殖。我們選取公認的MSC特異性細胞表面標志物進行流式細胞術測定[6],hMSC/Ad-HGF大小和顆粒度相對均一,細胞較均一地表達CD44和CD29,而不表達CD31,CD34,CD45和CD14,說明基因修飾前后的hMSC細胞表型沒有改變變。利用ELISA法測定培養上清HGF濃度,結果轉染Ad-HGF后,hMSC培養上清中HGF濃度顯著增加,達到80ng/mL,接近轉染前的3.8倍,而轉入hMSC/Ad-GFP的培養上清中HGF濃度未有顯著性變化。

[1]Friedenstein AJ,Gorskaja JF,Kulagina NN.Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs[J].Experimental Hematology,1976,4(5):267～274.

[2]Valtieri M,Sorrentino A.The mesenchymal stromal cell contribution to homeostasis[J].J Cell Physiol,2008,217:296～300.