內生拮抗菌Bacillus subtilis QZ-7抗茄子黃萎病研究

程 磊，楊廷憲，楊 佩，孫正祥，周 燚(長江大學農學院，湖北 荊州 434025)

內生拮抗菌BacillussubtilisQZ-7抗茄子黃萎病研究

程 磊，楊廷憲，楊 佩，孫正祥，周 燚(長江大學農學院，湖北 荊州 434025)

從開花期茄子的根內分離到對茄子黃萎病菌具有強烈抑制活性的拮抗菌株BacillussubtilisQZ-7，其抑菌帶寬達26.60mm。定殖試驗表明，QZ-7菌株能有效定殖于茄子根內，并能在茄子根際存活并保持較高菌量。對茄子種子萌發和幼苗生長影響試驗表明，該菌株可促進種子萌發，并具有明顯促進莖伸長生長的作用。室內盆栽試驗表明，單個菌株對茄子黃萎病的防效可達86%，且持效期較長。這些結果表明，QZ-7具有進一步研究開發的價值。

茄子黃萎病；枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) ；定殖；防效

黃萎病是一種世界性的土傳維管束病害，由輪枝菌屬大麗輪枝菌(VerticilliumdahliaeKleb)引起，俗稱半邊瘋、黑心病，是威脅茄子生產的重要病害之一，對茄子產量和品質造成嚴重影響。該病原菌可以微菌核的形式在植物衰老組織中存活數年并保持侵染能力[1]，在土壤中能存活14a或更長時間[2]。目前該病害的抗病品種缺乏[3]、化學農藥防效不佳。

黃萎病這類病害一直是農業生產中的難點。現在主要采取水旱輪作方式來控制該病害的發生，但由于水資源的限制，這一措施難以大面積推廣實施。因此，生物防治成為防治此類病害的重要措施，特別是植物內生菌，能高效定殖于植物體內、占據有利生態位、兼具促生和其他功能，將防治在植物土傳和維管束病害方面具有很強的應用前景。

本研究旨在從生物防治角度出發，從茄子根內根部篩選能定殖于茄子體內、對黃萎病菌具有很強拮抗作用的優勢內生菌株，來防治茄子黃萎病。

1 材料與方法

1.1 試驗菌種與培養基

茄子黃萎病原菌：由長江大學農學院提供;PSA培養基：用于病原菌培養。

篩選培養基：分別稱取新鮮茄子根100g、蔗糖5g、蛋白胨5g、酵母浸出粉2g和瓊脂15g，然后將100g茄子根用適量水煮沸10min，過濾，取過濾液，將蛋白胨、蔗糖和酵母浸出粉溶解，將溶液煮沸，加入瓊脂，完全溶解后定容至1000ml，調節pH 6.5～7.0，分裝，121℃高壓蒸汽滅菌，用于培養和篩選芽孢桿菌。

1.2 拮抗細菌的分離

在茄子開花期，選擇茄子黃萎病發生嚴重的田塊，挑選長勢好的健康茄子植株(植株莖稈切面無變褐現象，周圍其他植株發病嚴重)，取其主要根部及其相連部分莖，去皮，用自來水洗凈，在超凈工作臺上，用75%酒精消毒5min，再用0.1%升汞消毒2mim，滅菌水漂洗3次后剪碎，25℃下，滅菌水浸泡剪碎物24h(使維管束中的內生菌充分游離出來)，于80℃恒溫水浴鍋中處理20min(除去非芽孢桿菌細菌)，取液體30μl涂平板，25℃恒溫培養，待菌落長出，挑選芽孢桿菌及類似菌菌落，進行抑菌活性檢測。

1.3 拮抗細菌的活性檢測

初篩：用移液槍將茄子黃萎病原菌種子液轉接到裝有30ml PSA液體培養基的三角瓶(100ml)中， 25℃、150r/min搖床發酵培養48h，制得病原菌溶液；將PSA培養基熔化，待其溫度降到50℃時，用移液槍吸取1ml病原菌溶液，注入到50℃PSA培養基(200ml)中，混勻，倒平板，得到含病原菌平板。將分離所得的芽孢桿菌類似菌編號，于含病原菌的培養基上劃線，置25℃恒溫培養箱培養48h，選擇周圍具有明顯抑菌圈的拮抗細菌。

復篩：如前所述制備含茄子黃萎菌孢子的平板，在平板中用打孔器打直徑5mm的4個孔(3個孔做處理，1個孔做對照)用少許融化培養基封住孔底。將初篩的生防菌在篩選培養基(液體)中培養48h，將發酵液4℃、12000 r/min離心20min，取上清液，經0.22μm微孔濾膜過濾后，吸取100μl過濾液注入待測平板孔里，以滅菌水為對照，每處理重復3次，以抑菌圈半徑大小判定生防菌株的抑菌活性強弱，篩選抑菌能力強的菌株。

1.4 生防菌16S rDNA測序

利用PCR擴增生防菌的16S rDNA序列。選用E.coli16S rDNA通用上游引物: 5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ (E.coli16S rDNA bases 9～27) ；下游引物: 5’-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3’(E.coli16S rDNA bases 1525～1542)。PCR產物純化后與pMD-18T載體連接，轉化E.coliDH5α，挑選陽性克隆進行序列分析。

1.5 拮抗細菌對茄子萌發、幼苗生長的影響

將拮抗細菌液體發酵24h，用發酵液浸泡茄子種子1d(對照用自來水浸泡1d)，在培養皿內放2張濾紙，加無菌水保濕，將浸泡后的種子轉移到培養皿內，25℃恒溫培養，觀察種子萌發及生長情況。

將茄子地土壤(土壤為黑棕壤：有機質1.20%，堿解氮116.8mg/kg，速效磷10.4mg/kg，速效鉀140.5mg/kg，含水量42%，pH 6.8)取回，121℃高壓蒸汽滅菌，待冷卻后將拮抗細菌發酵液與土壤混合，分裝于換盆中，3次重復，將茄子播種于花盆內，以不加拮抗細菌的為對照，5d后記錄出芽率，30d比較根系生長情況。

1.6 拮抗菌定殖試驗

將茄子地土壤(土壤為黑棕壤：有機質1.20%，氮116.8mg/kg，速效磷10.4mg/kg，速效鉀140.5 mg/kg，含水量42%，pH 6.8)滅菌，裝于缽中(每缽裝2.5kg土壤)，每缽播5粒茄子種子(三月茄)，在光照12h、28℃、濕度80%和黑暗12h、24℃條件下濕度80%條件下于培養箱中培養，待茄子苗長至2～3心葉時用拮抗菌液接種：將已做標記的QZ-7配制成1×108cfu /ml菌液，分別澆灌于茄子根部(每株澆菌液10ml)，以不接菌的為對照，每個處理5缽，共50株茄子苗。

在處理后的15、30、45、60、75d測定菌株的定殖力。取植株主要根部及近地莖桿(根莖交界處到子葉著生處之間)，去皮，分別稱重，表面消毒，剪碎，于25℃下用10ml無菌水浸泡24h后，取浸泡液稀釋后涂平板(含氨芐西林200μg/ml)，計算茄子維管束中菌數量。

1.7 盆栽防治試驗

將茄子地土壤(土壤為黑棕壤：有機質0.9%，氮112.8mg/kg，速效磷10.2mg/kg，速效鉀139.5mg/kg，含水量50%，pH 6.9)、營養土，按50∶50(質量比)比例混合，再與拮抗細菌(液體發酵24h，1×108cfu/ml，按1ml/kg混合)和黃萎病菌(50cfu/ml孢子懸浮液，按1ml/kg混合)混合，分裝于花盆中，以不接黃萎病菌的為對照，每缽播種10粒種子，每處理5次重復，在光照12h、28℃、濕度80%和黑暗12h、24℃條件下濕度80%條件下于培養箱中培養，處理如下：(1) QZ-7發酵液，1×108cfu/ml； (2)對照：清水處理。在澆灌后30d、45d和60d調查發病率和病情指數。

防效=[(對照組病情指數-處理組病情指數)/對照組病情指數]×100%；

病情指數=[∑(病級株數×代表數值)×總株數×發病最重級的代表數值]×100。

2 結果與分析

2.1 拮抗細菌的分離與鑒定

圖1 QZ-7對茄子黃萎病菌的抑制作用

經分離純化后共得到210株細菌菌株。采用平板劃線對峙法初篩得到18株活性較強的茄子黃萎病拮抗菌株，編號QZ-1、QZ-2、QZ-3、……、QZ-18。復篩結果顯示，菌株QZ-7的抑菌效果最佳，抑菌帶寬達26.60mm(打孔器直徑為5mm)以上，而對照幾乎不表現出抑菌活性(圖1)。

在此基礎上，利用PCR技術對菌株QZ-7的16S rDNA序列進行擴增，與GenBank 數據庫中的序列進行同源比較，發現它與枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)A23菌株的16S rDNA序列(GenBank: AB526464.1)有極高的同源性，相似性高達99%，初步把該菌株命名為枯草芽孢桿菌QZ-7。

2.2 拮抗細菌對茄種子萌發、幼苗生長的影響

結果表明，經QZ-7菌株處理后的茄種子和對照的出芽率沒有明顯區別，均在80%左右，但在出芽和生長速度方面有明顯區別。經QZ-7菌株處理后的茄種子在第3d均開始出芽，而對照未出芽；在第5d時，QZ-7菌株處理后的種子幼苗根系比對照明顯伸長，最長可達44mm，下胚軸長15～20mm，而對照第5d開始出芽，根長僅5mm，上胚軸伸長不明顯(圖2、圖3)。

圖2 QZ?7對茄子種子發芽的影響

圖3 QZ?7處理5d后茄子幼苗根系長度和下胚軸長度

經QZ-7處理后種于花盆中，30d其長勢旺于對照，植株高度明顯高于對照(圖4)，植株莖直徑也大于對照，但根系不及對照發達(圖5)。

圖4 QZ-7對茄子生長長勢的影響

圖5 QZ-7對茄子根系的影響

2.3拮抗菌在茄子根際的定殖情況

圖6 QZ-7菌株在茄子根際的定殖情況

定殖試驗表明，在經標記過的QZ-7灌根的茄子根部維管束中均分離出了帶標記的拮抗細菌：處理后10d分離出了QZ-7，之后其含量呈上升趨勢，在30d左右達到高峰(3.1×105 cfu/g)，之后出現下降趨勢，在40d和50d其含量相當 (圖6)。

2.5盆栽防治情況

盆栽防治試驗結果顯示：(1)從時間上看，經QZ-7處理后的茄子發病率和病情指數一直保持較低水平，而對照的發病率和病情指數都相對較高；(2)QZ-7處理后，其防效可以達到86%以上，隨著茄子苗的生長，病害發生率和病情指數均保持穩定，而對照有不斷加劇的趨勢(表1)。

表1 QZ-7對茄子黃萎病的室內防治試驗結果

3 討論

植物內生菌是一個多樣性的特殊微生物類群，受到研究者的高度關注，因為植物內生菌占據植物體內有利的生態位，具有生物防治、促進植物生長、增強宿主抗逆境、抗病蟲害、抗菌、抗病毒和抗腫瘤活性等優點[4-6]。本研究從茄子根莖維管束內篩選得到抑菌活性較強的菌株QZ-7，在PSA平板上對茄子黃萎病的抑菌帶寬度均可達26.6mm(打孔器直徑5mm)以上，說明該菌株的抑菌活性很強，同時QZ-7菌株對茄子具有較強的促生作用。

QZ-7在茄子的根際定殖結果表明，該菌株能長時間有效地定殖于茄子根際，而在不同的時間段，QZ-7菌株在茄子根部的種群含量是波動的，這可能是因為植物在不同的生育期，其體內物質是變化的，導致菌群的種群結構也發生相應的變化。

盆栽試驗表明，QZ-7對茄子黃萎病具有很高的防效(86%以上)，隨著時間的推移，經處理過的茄子病情指數有小幅下降趨勢，說明這些菌株還對作物具有一定的治療作用。

因此，該菌株是一株能有效定殖于茄子根部，并且能長時間存活于田間土壤的細菌，在抗茄子黃萎病方面具有很好的應用潛力。

[1]Arslan M,Dervis S.Antifungal activity of essential oils against three vegetative compatibility groups ofVerticilliumdahliae[J].World J Microbiol Biotechnol，2010，26:1813-1821.

[2]Soesanto L，Termorshuizen A J.Effect of temperature on the formation of microsclerotia ofVerticilliumdahliae[J].J Phytopathol，2001,149:685-691.

[3]劉富中，連 勇，陳鈺輝，等.“ 十五 ” 期間我國茄子遺傳育種研究進展[J].中國蔬菜，2006，(3)：31-34.

[4]賈 栗，陳疏影，翟永功，等．近年國內外植物內生菌產生物活性物質的研究進展[J].中草藥，2007，38(11)：1750-1754．

[5]Benhamou N，KioIOFPPER J W，QUADT-HAILM A,et al.Induction of defense related ultrastrurual modifications in pea root tissues inoculated with endophytic bacteria [J].Plant Physiology，1996,1123：919-929.

[6]孫力軍，陸兆新，別小妹，等．1株抗菌植物內生菌EJH-2菌株的分離和鑒定[J]．中國微生物學雜志，2006，18(1)：23-26.

S476：S435.621

A

1673-1409(2012)06-S001-04

2012-06-10

湖北省教育廳重大項目 (Z20091201)；國家大學生創新性實驗計劃項目(091048922)。

程 磊(1987-)，男，安徽阜陽人，現從事植物保護研究。

周 燚，E-mailyiyizhzh@yahoo.com.cn。

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2012.06.001