TLR4、MyD88mRNA在膽脂瘤型中耳炎中的表達

楊珍珍 張莉萍

（山西醫科大學第二醫院，山西 太原 030001）

盡管中耳膽脂瘤的成因及其上皮的來源仍存在很多爭議，但基本達成共識的是膽脂瘤的形成與機體為防御慢性炎癥而產生的一系列異常免疫應答有關。免疫反應的異常是造成膽脂瘤持續發展和骨質破壞的內在重要因素[1,2]。Toll樣受體（toll.1ikereceptors，TLRs）是先天性免疫模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）之一，通過識別病原微生物及其細胞壁產物的特殊結構即病原相關分子模式（pathogen associated molecularpatterns，PAMPs）迅速激活天然免疫系統[3]。現Szczepanski等[4]研究發現TLR（TLR-2，TLR-3，TLR-4）在膽脂瘤微環境中表達豐富，提示TLR4可能參與膽脂瘤型中耳炎的發病。本實驗擬用RT-PCR法觀察中耳膽脂瘤組織中TLR4的變化及其下游傳導分子MyD88的表達，進一步探討TLR4信號轉導途徑在中耳膽脂瘤發病中的作用。

1 材料與方法

1.1 標本

中耳炎組標本組織來自山西醫科大學第二醫院耳鼻咽喉-頭頸外科住院患者35例（男13例，女22例，年齡16～62歲）平均37.12歲，耳流膿史1個月～30年，平均5.14年；聽骨無破壞者8例，破壞1個8例，破壞2個13例，破壞3個6例。在術中取標本時根據顯微鏡下所見上皮下基質炎性反應的程度，取樣分為炎癥組和非炎癥組，其中炎癥組13份，非炎癥組12份。對照組為正常外耳道皮膚組織10例，亦取自中耳術中。上述所有標本在顯微鏡下仔細剔除膽脂瘤鱗屑及其他壞死組織，置于一80℃冰箱保存，用作RT-PCR檢測。所有患者術前均行顳骨高分辨CT檢查，術后病理活檢均證實為后天繼發性膽脂瘤。

1.2 主要試劑與儀器

RT-PCR相關試劑（TAKARA公司）.引物合成（深圳華大基因研究所），引物序列如表1。PCR擴增儀為STRATAGENE公司產品。

表1 3種基因的引物序列及產物基因

1.3 總RNA制備和逆轉錄

取組織50mg，加入1mL Trizol，超聲勻漿。加入200μL氯仿，劇烈振蕩混勻30s，于4℃ 12000rpm離心5min，將上清液移入另一EP管中，加入等體積異丙醇，室溫放置5min，4℃ 12000rpm離心5min以沉淀RNA，用70%乙醇1mL洗滌沉淀2次，4℃ 12000rpm離心2min，EP管底部可得RNA沉淀，用50μL 0.1%DEPC水溶解后可作為反轉錄的模板。cDNA合成按Rever Tra Ace-a-逆轉錄酶試劑盒說明完成。

1.4 實時定量PCR

PCR反應體系為：FastStart Universal SYBR Green Master （ROX）10μL，上游引物（15uM）0.5μL，下游引物（15uM）0.5μL，cDNA 2μL，無DNAse和RNAse的水7μL，共20μL。PCR 反應條件：94℃預變性10min，活化Tag酶；94℃15s，60℃60 s，45個循環結束。熒光定量PCR讀取CT（cycle threshold）值。

1.5 統計學方法

用2-ΔΔCT法處理實時熒光定量RT-PCR數據，采用SPSSl3.0 for windows軟件包處理獲得的數據，以Explore過程對數據進行探索性分析，由于實驗組標本值2-ΔΔCT不符合正態分布，以非參數秩和檢驗進行統計分析。結果以中位數和最大最小值范圍來表示，以P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 TLR4水平的改變

炎癥組TLR4平均2-ΔΔCT值分別為0.689（0.200，2.050），非炎癥組TLR4平均2-ΔΔCT值分別為0.291（0.020，0.990），正常對照組TLR4、平均2-ΔΔCT值分別為0.163（0.001，0.990）。見圖1。

圖1 炎癥組、非炎癥組、正常對照組TLR4 mRNA的表達

2.2 MyD88水平的改變

炎癥組為MyD88平均2-ΔΔCT值0.777（0.320，1.84）；非炎癥組MyD88平均2-ΔΔCT值為0.320（0.01，0.990），正常對照組MyD88平均2-ΔΔCT值為0.224（0.002，0.990），見圖2。

圖2 炎癥組、非炎癥組、正常對照組MyD88 mRNA的表達

3 討 論

慢性化膿性中耳炎是耳鼻咽喉科一個常見的疾病，膽脂瘤型中耳炎是中耳慢性化膿性炎的一個類型，發病率占慢性化膿性中耳炎的20%，它主要以上皮細胞增生、角化上皮脫屑堆積為特征，雖然其不產生與惡性腫瘤同樣的無限增殖，但它可以引發骨破壞，激發蝕骨，侵略性地侵蝕中耳及內耳的結構，引起嚴重的顱內并發癥，如并不少見的永久性的聽力損失、 前庭功能障礙等，嚴重危害人類健康。大多數學者把膽脂瘤骨質破壞的機制解釋為慢性炎性作用的結果。Suzuki等[5]發現，膽脂瘤囊的破裂可引起局部炎癥和骨質破壞，并伴隨著相同部位小膿腫的形成，他們還觀察到穿孔部位有明顯的炎性細胞浸潤和上皮增殖，說明了膽脂瘤骨質破壞與炎癥之間的聯系。

馬鑫[6]等研究發現，膽脂瘤原發部位的差別對于膽脂瘤的侵襲性沒有明顯影響，主要是伴發炎性反應的輕重對于膽脂瘤的預后以及侵襲性有明顯影響，膽脂瘤周圍炎性反應越重，侵襲性越強。基于以上，了解膽脂瘤的炎癥反應機制，尤為重要。

1997年，Medzhitov等[7]首次在人類細胞表現了Toll樣受體，TLR的發現對免疫學的發展產生了積極而深遠的影響。TLR最突出的生物學功能是促進細胞因子的合成與釋放，引發炎性反應。已經有研究發現在膽脂瘤微環境中，有大量TLR4的表達，本研究根據顯微鏡下觀察膽脂瘤上皮下基質，將中耳膽脂瘤組分為炎癥組和非炎癥組，發現在炎癥程度強的組織中，有大量的TLR4表達，而在炎癥程度相對較弱的膽脂瘤組織中，有TLR4的表達，但明顯少于炎癥組；相比較膽脂瘤組，正常對照組僅有微量表達。

TLR4識別配體后發生二聚化，二聚體的刺激信號通過胞內Toll/IL-1 R區（Toll/IL-1 R domain，TIR）傳遞給下游的信號分子經過一系列蛋白級聯反應和磷酸化作用，產生炎性反應[8]。目前發現TLR4信號通路有2條：一條為MyD88依賴信號途徑，另一條為MyD88非依賴信號途徑。在MyD88依賴途徑中，TLR4寡聚化后募集含TIR（Toll-interleukin-1receptor）結構域的接頭蛋白TIRAP （TIP domain-containing adaptor protein）和MyD88。然后MyD88下游的接頭蛋白IRAK4（IL-1 receptor-associated kinase-4）、TRAF6（TNF report-associated factor 6）和TAKl（TGFβ-activated kinase 1）被募集并活化，而TAKl激活IKK-NF-κB通路和MAPK通路，最終導致前炎性因子的表達[9]。本實驗研究發現，同TLR4一樣，MyD88在炎癥組中有大量表達，非炎癥組次之，正常對照組有微量表達。說明在膽脂瘤發生、發展過程中，TLR4-MyD88信號轉導途徑可能參與了炎性反應。

本實驗結果顯示在膽脂瘤中耳炎過程中，膽脂瘤組織內TLR4、MyD88的表達量隨著炎癥程度的加重而增多。這有助于對人天然免疫和獲得性免疫啟動的認識，并進一步了解TLR4傳導通路在膽脂瘤型中耳炎發病機制中的作用。而且可以為該病的免疫治療提供理論依據。如：在膽脂瘤發病早期（慢性化膿性中耳炎）時就進行免疫干預治療，阻止或延緩疾病的發展。

[1]Albino AP,Kimmelman CP,Parisier SC.Cholesteatoma: a molecular and cellular puzzle1[J].Am J Otol,1998,19(3):266-272.

[2]林刃輿,遲放魯.中耳膽脂瘤形成機理的研究進展[J].國外醫學耳鼻咽喉科學分冊,2001,25(3): 153-156.

[3]Janssens S,Beyaert R.Role of Toll-like receptors in pathogen recognition[J].Clin Microbiol Rev,2003,16(4):637-646.

[4]Szczepanski M,Szyfter W,Jenek R,et al.Toll-like receptors2,3and4(TLR2,TLR3andTLR4)are expressed in the microenvironment of human acquired cholesteatoma[J].Eur Arch Otorhinolaryngol,2006,263(7):603-607.

[5]馬鑫,余力生,夏瑞明.不同部位膽脂瘤侵襲性免疫組化的比較[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2006,41(8):574-578.

[6]Suzuki C,Ohtani I.Bone destruction resulting from rup ture of a cholesteatoma sac: temporal bone pathology[J].Otol Neur otol,2004,25(5): 674-677.

[7]Medzhitov R,Preston-Hurlburt P,Janeway CA.A human homoLogue of the Drosophila Toll protein signal sactivation of adaptiveimmunity[J].Nature,1997,388(6640):394-397.

[8]Lu YC,Yeh WC,Ohashi PS.LPS/TLR4 signal transduetion p pathway[J].Cytokine,2008,42(2):145-151.

[9]黃宏耀,梁馮,寧勇.Toll樣受體介導的信號轉導通路及其與炎癥和腫瘤的天系[J].湖北中醫學院學報,2008,12(4):34-36.