蜂蜜中鏈霉素多種檢測方法比較

趙曉鳳 （新疆獸藥飼料監察所 烏魯木齊 830000） 何方洋 汪善良 張禹 李勇 田甜 陳連星 （北京勤邦生物技術有限公司）

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蜂蜜中鏈霉素多種檢測方法比較

趙曉鳳 （新疆獸藥飼料監察所 烏魯木齊 830000） 何方洋*汪善良 張禹 李勇 田甜 陳連星 （北京勤邦生物技術有限公司）

采用膠體金免疫層析法、酶聯免疫法與液相色譜-串聯質譜法三種常用分析方法對蜂蜜中殘留的鏈霉素進行檢測，考察了三種方法的符合率。結果表明，膠體金免疫層析法具有操作簡便、快速、直觀的特點，酶聯免疫法靈敏度高適合作為快速篩選方法，液相色譜-串聯質譜法可進行陽性樣品的確證和精確定量。

鏈霉素 膠體金免疫層析法 酶聯免疫法 液相色譜-串聯質譜法 蜂蜜

鏈霉素(Streptomycin, SM)是一種常見的氨基糖苷類抗生素，是目前我國畜牧業和水產業中的常用藥物之一。但其耐藥性強，毒副作用較大，若動物性食品中有過量的鏈霉素殘留，則可能對人造成嚴重危害。為了保障動物源性食品的安全，歐盟2377/90/EEC(703/2007修訂) 規定動物性食品肌肉、脂肪、肝臟中鏈霉素最大殘留限量(MRLs)為500μg/kg，腎臟中為1000μg/kg，奶中為200μg/kg[1]。我國農業部第235號文件《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中規定鏈霉素在牛奶中殘留限量為200μg/L，在肌肉、脂肪、肝中為600μg/kg，在腎中為1000μg/kg。

目前鏈霉素殘留的檢測方法主要包括微生物法、免疫學法、液相色譜法、質譜法、毛細管電泳法等[2-12]。如化學發光法檢測水產品中鏈霉素檢出限為0.05μg/g[4]；高效液相色譜柱后衍生物法測定蜂王漿中的鏈霉素檢出限0.005mg/kg[5]；雙柱固相萃取凈化-液相色譜-串聯質譜測定牛奶和奶粉中鏈霉素和雙氫鏈霉素，牛奶檢出限為4μg/kg，奶粉檢出限為30μg/kg[6]；超高效液相色譜-串聯質譜法測定奶粉中鏈霉素與雙氫鏈霉素，檢出限為0.01mg/kg[7]；HPLC-MS/MS測定蜂蜜中鏈霉素和雙氫鏈霉素，鏈霉素檢出限0.002mg/kg，雙氫鏈霉素0.001mg/kg[8]；提取凈化及液相色譜檢測方法檢測蜂王漿中鏈霉素檢出限為10μg/kg[9]；親水作用色譜-串聯質譜法測定蜂蜜中的鏈霉素和雙氫鏈霉素，最低定量限分別為0.5μg/kg和1.0μg/kg[10]；以HPLC為代表的色譜技術已被證明為最有效的確證性檢測食品中農獸藥殘留的手段之一。但由于儀器較昂貴、費用高，不適合進行大規模現場檢測，而免疫學方法具有靈敏度高、成本低、大規模檢測等優點，應用膠體金免疫層析技術研制出鏈霉素殘留快速檢測試紙，檢測限為8μg/L[11]。采用ELISA法檢測牛奶中鏈霉素殘留量檢測限可達20μg/L或以下，符合快速篩選方法的要求[12]。免疫測定方法的建立是未來抗生素殘留檢測的主要研究方向，而多方面技術的結合與應用將是主要的研究手段[3]。

本文采用膠體金免疫層析法、酶聯免疫法、液相色譜-串聯質譜法三種方法對蜂蜜中鏈霉素的檢測進行了比較，結果表明這三種方法具有很好的符合率，能滿足不同的檢測要求。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

鏈霉素標準品，Sigma公司生產；磷酸、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、中性氧化鋁分析純、庚烷磺酸鈉、甲酸、甲醇、乙腈色譜純、鏈霉素快速檢測試紙條、鏈霉素ELISA檢測試劑盒均由北京勤邦生物技術有限公司提供。

KS-Ⅱ振蕩器，上海躍進醫療器械廠；DSY-Ⅲ氮吹儀，北京金科精華苑科技有限公司；QL-901漩渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Anke GL-20G-Ⅱ高速離心機，上海安亭科學儀器有限公司；2000SBL電子天平，美國Setra公司；MK3酶標儀和微量移液器(單道20~200μl、100~1000μl，多道50~ 300μl)，美國Thermo公司；Acquity液相色譜串聯質譜儀(配有電噴霧離子源)及Xcalibur1.2數據處理系統，美國Waters公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 膠體金免疫層析法 （1）樣品前處理：準確稱取0.5g蜂蜜到4ml離心管中，加入樣本提取液1.5ml，渦動1min，混勻待檢。（2）檢測方法：吸取100μl待檢樣本溶液于微孔中，緩慢抽吸使其充分與微孔中試劑混勻。將標記好的試紙條插入微孔中，印有“MAX”線端朝下，使之充分浸入溶液中。室溫(20~25℃)孵育5min后，取出試紙條，根據示意圖判定結果。（3）檢測結果分析：當樣品為陰性(－)時，檢測線(T線)顯色強于質控線(C線)顯色或與C線顯色無明顯差異，表示蜂蜜樣本中不含有鏈霉素或其濃度低于檢測限。當樣品為陽性(+)時，T線顯色明顯弱于C線顯色或T線不顯色，表示蜂蜜樣本中鏈霉素濃度等于或高于檢測限。當C線不顯色時，表明不正確的操作過程或試紙條已失效。

1.2.2 酶聯免疫法 （1）樣品前處理：方法一：稱取1.0g蜂蜜樣本至50ml聚苯乙烯離心管中，加入10ml提取緩沖液(參見產品說明書)，用振蕩器振蕩10min至蜂蜜全部溶解，4000r/min室溫(20~25℃/68~77℉)離心10min，直至清亮。用RIDA C18柱(純化提取物)，用2ml甲醇洗柱子，流速為60滴/min；用2ml去離子水洗柱子，流速為60滴/min；取2ml樣本以流速為15滴/min過柱；用3ml去離子水洗柱子，45滴/min；用空氣吹干柱子；除去柱中水分，用1ml甲醇洗脫樣本，流速為15滴/min；在40~50℃水浴氮氣流下完全蒸發溶劑；用2ml提取工作液(參見說明書)溶解干燥的殘留物；取50μl進行分析。方法二：稱取1.0g蜂蜜樣本至50ml聚苯乙烯離心管中，加入5ml 提取工作液，用振蕩器振蕩10min至蜂蜜全部溶解，4000r/min室溫(20~ 25℃/68~77℉)離心10min，直至清亮；取200μl清亮上清液，加入600μl提取工作液中混勻；取50μl進行分析。（2）檢測方法：按照北京勤邦生物技術有限公司鏈霉素ELISA檢測試劑盒說明書進行檢測。（3）檢測結果分析：標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個標準(0標準)的吸光度值，再乘以100%。以標準品百分吸光率為縱坐標，以鏈霉素標準品濃度的對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中鏈霉素實際殘留量。

1.3 液相色譜-串聯質譜法

1.3.1 標準工作溶液的配制 稱取鏈霉素配制成100μg/ml的標準儲備溶液，再用空白樣品溶液將標準儲備液稀釋成0μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、150μg/L的標準工作溶液。

1.3.2 樣品溶液的制備 參考“GB/T 22995-2008 蜂蜜中鏈霉素、雙氫鏈霉素和卡那霉素殘留量的測定液相色譜-串聯質譜法”標準方法中的7.1步驟進行蜂蜜樣品制備。

1.3.3 色譜及質譜條件 （1）色譜條件：Acquity UPLC?BEH C18柱(2.1×100mm，粒徑1.7μm)；柱溫為30℃；流動相為A相：0.1%七氟丁酸，B相：乙腈；流速0.2ml/min；進樣量5μl。流動相及梯度洗脫條件見表1。（2）質譜條件：離子源為電噴霧離子源；掃描方式為正離子掃描；檢測方式為多反應監測；電離電壓0.5KV；離子源溫度150℃；脫溶劑溫度 350℃；碰撞氣流速 0.15ml/min；錐孔氣流速50L/hr；脫溶劑氣流速550L/hr。（3）檢測結果分析：采用外標法對樣品中殘留的鏈霉素進行定量分析。以鏈霉素藥物標準品的相對豐度為縱坐標，以不同濃度梯度的標準品工作液濃度(μg/L)為橫坐標，繪制標準曲線。將樣品中相對豐度代入標準曲線中，從標準曲線上讀出對應的鏈霉素藥物的濃度，即為樣品中鏈霉素藥物實際殘留量。

表1 流動相及梯度洗脫條件 （min，%）

2 結果與分析

2.1 標準曲線繪制

2.1.1 酶聯免疫法標準曲線 分別測定鏈霉素標準品濃度為0ng/L、50ng/L、150ng/L、450ng/L、1350ng/L、4050ng/L的吸光度，建立鏈霉素標準曲線如圖1，IC50值為152.0ng/L。

圖1 鏈霉素ELISA標準曲線

2.1.2 LC-MS/MS法標準曲線 分別取鏈霉素標準品濃度為0μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、150μg/L，經LC-MS/MS法分析，標準曲線見圖2，標準曲線y=27.31x +0.698，R2=0.998。

圖2 鏈霉素LC-MS/MS標準曲線

2.2 檢測限

2.2.1 膠體金試紙條檢測限 在空白蜂蜜樣品中分別添加鏈霉素標準品至終濃度為：10μg/kg、20μg/kg、40μg/kg；取試紙條進行測試，每個濃度測定5個重復，驗證試紙條的最低檢測限。檢測結果顯示：在蜂蜜樣品中添加鏈霉素至終濃度為10μg/kg時試紙條檢測結果均顯示陰性，當蜂蜜樣品中添加鏈霉素至終濃度為20μg/kg、40μg/kg時試紙條檢測結果均顯示陽性；可判讀鏈霉素膠體金試紙條在蜂蜜樣品中的檢測限為20μg/kg。

2.2.3 液相色譜及串聯質譜法檢測限 最低檢測限按照定量離子信噪比3:1計算，得該方法在蜂蜜樣品中檢測限為5.0μg/kg。

2.3 三種方法檢測實際樣品結果比較

運用三種方法對20份蜂蜜樣品進行檢測，三種方法測定的結果基本一致。其中檢測出一份陽性樣本，ELISA檢測結果為310.8μg/kg，LC-MS/MS法檢測結果為301.9 μg/kg，鏈霉素標準品質量色譜圖如圖3，檢測出的陽性樣品質量色譜圖如圖4。

圖3 鏈霉素標準品(50μg/L)質量色譜圖

圖4 陽性樣品質量色譜圖

3 結論

本試驗采用三種方法對蜂蜜中殘留的鏈霉素進行了檢測，如果蜂蜜樣品中有結晶，需要置于不高于60℃水浴中溫熱，待蜂蜜全部融化后攪拌均勻，冷卻至室溫后進行檢測。在ELISA檢測的洗滌過程中，要用吸水紙拍干以保證完全除去微孔中的液體，從而避免影響后續測試。

采用三種方法對蜂蜜樣品進行檢測，檢測結果顯示基本一致。膠體金試紙條是一種基于免疫反應的快速檢測方法，該方法簡便(不需要，或只進行簡單的前處理，操作簡單易掌握)、快速，性能穩定，重復性好，適合于進行現場樣品的快速篩選，但由于其通過肉眼判斷顏色色度進行結果判斷，不能測定藥物的準確含量故只能用于定性粗篩。酶聯免疫試劑盒重復性好、準確度高，比試紙條靈敏度高，也適合作為快速篩選方法。LC-MS/MS方法是實驗室常用的檢測方法之一，具有較高的靈敏度和穩定性，可以對樣品進行確證和精確定量，但由于對樣品前處理要求較高，需要先進的分析儀器，成本也較高。因此在實際檢測中可以選擇膠體金試紙條等快速檢測方法作為對樣品的快速初篩方法，再將篩查的陽性樣品采用儀器方法進行確證和精確定量。

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（2012–06–16）

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1007-1733(2012)08-0001-04