HPLC法測定聯(lián)苯乙酸凝膠含量和有關(guān)物質(zhì)

汪平，張軍兵，武惠斌，聶紅梅（1.河南羚銳制藥股份有限公司，河南新縣465550；2.北京羚銳偉業(yè)科技有限公司，北京 100070）

HPLC法測定聯(lián)苯乙酸凝膠含量和有關(guān)物質(zhì)

汪平1，2＊，張軍兵1，2，武惠斌1，2，聶紅梅1，2（1.河南羚銳制藥股份有限公司，河南新縣465550；2.北京羚銳偉業(yè)科技有限公司，北京 100070）

目的：建立測定聯(lián)苯乙酸凝膠的含量和有關(guān)物質(zhì)的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Kromasil C18，流動相為甲醇-0.1%冰醋酸（65∶35），流速為1.0mL·min－1，檢測波長為254nm。結(jié)果：聯(lián)苯乙酸檢測濃度線性范圍為0.3～60μg·mL－1（r＝0.9998），低、中、高濃度平均回收率分別為100.3%、101.2%、99.8%，RSD＝0.24%（n＝9）；3批樣品主藥和有關(guān)物質(zhì)含量均符合限度要求。結(jié)論：本方法簡便快速、重復(fù)性好，可用于控制聯(lián)苯乙酸凝膠的質(zhì)量。

聯(lián)苯乙酸凝膠；有關(guān)物質(zhì)；含量；高效液相色譜法

聯(lián)苯乙酸為非甾體抗炎藥，由日本Lederle公司研制，其凝膠劑1986年首先在日本上市，局部用于消炎鎮(zhèn)痛，主要用于變形性關(guān)節(jié)炎、肩周炎、腱鞘炎、腱周炎、肌肉痛、外傷后腫脹疼痛、軟組織損傷等的鎮(zhèn)痛消炎[1]。為控制該制劑質(zhì)量、保證臨床療效，筆者對其含量和有關(guān)物質(zhì)測定方法進(jìn)行了研究。

1 儀器與試藥

LC-20A型高效液相色譜（HPLC）儀，包括SIL-20A自動進(jìn)樣器、CTO-20A柱溫箱、SPD-20A紫外-可見檢測器、LC Solution色譜工作站（日本島津公司）；CP225D型電子天平（德國Sartorius公司）。

樣品：聯(lián)苯乙酸凝膠（北京羚銳偉業(yè)科技有限公司，批號：000703、000704、000705，規(guī)格：10g∶0.3g）；聯(lián)苯乙酸原料藥（天津藥物研究院，批號：000512，純度：99.98%）；聯(lián)苯乙酸對照品（英國LGC公司，批號：Y0000731，純度：100%）；聯(lián)苯對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110843-9501，純度：100%）；鄰苯基苯甲酸對照品（批號：A0270674，純度：99.8%）、4-乙酰聯(lián)苯對照品（批號：MKBG0866V，純度：99.9%）均系美國SigmaAldrich公司產(chǎn)品；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 有關(guān)物質(zhì)

鄰苯基苯甲酸為聯(lián)苯乙酸合成過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，聯(lián)苯為聯(lián)苯乙酸的起始原料，4-乙酰聯(lián)苯為聯(lián)苯乙酸的降解產(chǎn)物。但因?yàn)猷彵交郊姿嵩诼?lián)苯乙酸原料藥的質(zhì)量研究中并未檢出，故在聯(lián)苯乙酸凝膠中不作為已知雜質(zhì)考察，但將其與聯(lián)苯乙酸的分離度用以考察系統(tǒng)適用性。

2.1.1 色譜條件[2]。色譜柱：Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm）；柱溫：30℃；流動相：甲醇-0.1%冰醋酸（65∶35），流速：1.0mL·min－1；檢測波長：254nm。理論板數(shù)按聯(lián)苯乙酸峰計不低于5000。

2.1.2 測定法。供試液：取樣品適量（相當(dāng)于聯(lián)苯乙酸3mg），精密稱定，加流動相溶解并定量稀釋至10mL量瓶中，搖勻，過濾，即得。對照液（1）：取供試液3倍體積，加流動相稀釋到100倍體積，再取此溶液1倍體積加流動相稀釋到10倍體積，搖勻，即得。對照液（2）：取4-乙酰基聯(lián)苯與聯(lián)苯對照品適量，精密稱定，以少量甲醇溶解后，加流動相定量稀釋成每1mL中含4-乙酰聯(lián)苯0.3μg、聯(lián)苯0.3μg的混合溶液，即得。

取對照液（1）20μL進(jìn)樣，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分峰高約為滿量程的15%，再取供試液和對照液（1）、（2）各20μL，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的3倍。供試液的色譜圖中如出現(xiàn)與對照液（2）中2個主峰相對應(yīng)的峰，其任何一個峰面積均不得大于相對應(yīng)的主峰面積（每個0.1%）；其他單個雜質(zhì)峰面積均不得大于對照液（1）主峰面積的1/3（0.1%）；未知雜質(zhì)總和不得過1.0%。空白基質(zhì)、對照液（1）、對照液（2）、供試液色譜詳見圖1。

2.1.3 線性關(guān)系考察。取樣品適量，照供試液的制備方法制成每1mL中約0.5mg的溶液，分別精密量取該溶液適量，加流動相制成每1mL中約含聯(lián)苯乙酸2、4、6、8、10μg的溶液，分別進(jìn)樣。以濃度（c）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)，擬合曲線，得方程A＝5502.3c+45.1（r＝0.9996）。結(jié)果表明，聯(lián)苯乙酸檢測濃度線性范圍為2～10μg·mL－1。

2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn)。取樣品（批號：000703）6份，制備成供試液后測定，結(jié)果RSD＝0.22%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.5 強(qiáng)制降解試驗(yàn)。取聯(lián)苯乙酸凝膠適量照供試液制備方法制備成1.5mg·mL－1的溶液作為貯備液。分別取貯備液適量用1mol·L－1的鹽酸、1mol·L－1的氫氧化鈉、80℃高溫、30%雙氧水、4000lx光照破壞放置3h后定容至濃度為0.3mg·mL－1的溶液，濾過，作為供試品溶液測定，并同法制備空白溶液測定。結(jié)果本品比較穩(wěn)定，堿、高溫條件下略有降解，約降解0.5%和0.8%，其他條件下幾乎未降解，詳見圖2。

圖1 有關(guān)物質(zhì)檢查中相關(guān)高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of related substances

圖2 有關(guān)物質(zhì)降解試驗(yàn)高效液相色譜圖1.堿破壞后樣品；2.樣品；3.酸破壞后樣品；4.高溫破壞后樣品；5.空白；6.氧化破壞后樣品；7.光照破壞后樣品Fig 2HPLC chromatograms of degradation experiment of related substances1.sample destroyed by alkaline；2.sample；3.sample destroyed by acid；4.sample destroyed by high temperature；5.blank control；6.sample destroyed by oxidation；7.sample destroyed by light

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)。取供試液1份，分別放置0、2、4、6、8h測定，結(jié)果RSD＝0.83%，表明供試液放置8h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果。3批樣品中雜質(zhì)含量均符合限度要求，詳見表1。

表1 3批樣品中有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果Tab 1 Result of related substances test of 3batches of samples

2.2 主藥含量測定

2.2.1 色譜條件與線性關(guān)系考察。色譜條件同“2.1.1”項(xiàng)，線性關(guān)系考察方法操作同“2.1.3”項(xiàng)，分別制備濃度為0.3、3、6、9、12、24、30、36、47.5、60μg·mL－1的聯(lián)苯乙酸對照品溶液進(jìn)樣分析，得回歸方程A＝151604c－25888（r＝0.9998），聯(lián)苯乙酸檢測濃度線性范圍為0.3～60μg·mL－1。

2.2.2 分離度測定。精密稱取聯(lián)苯乙酸和鄰苯基苯甲酸對照品適量，用流動相制備成各含4μg·mL－1混合溶液，進(jìn)樣分析，記錄色譜峰，計算2個主峰之間的分離度。結(jié)果，聯(lián)苯乙酸和鄰苯基苯甲酸保留時間分別為10.175、13.628min，分離度為7.93，詳見圖3。

圖3 分離度試驗(yàn)高效液相色譜圖Fig 3 HPLC chromatograms of separation degree test

2.2.3 精密度試驗(yàn)。分別取濃度為3、6μg·mL－1的聯(lián)苯乙酸對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果RSD分別為0.65%和0.71%，表明本法精密度良好。

2.2.4 回收率試驗(yàn)。精密稱取本品空白基質(zhì)0.134g 9份，各置于50mL量瓶中，分別加入濃度為1mg·mL－1的聯(lián)苯乙酸對照品溶液3（80%）、4（100%）、5（120%）mL各3份，加流動相定容至刻度搖勻；再精密量取此液1mL置于20mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度搖勻，濾過，進(jìn)樣測定。得低、中、高濃度平均回收率分別為100.3%、101.2%、99.8%，RSD＝0.24%（n＝9）。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn)。取同一批樣品（批號：000703）按“2.2.6”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，測定6次，結(jié)果RSD＝0.45%，表明本方法的重復(fù)性好。

2.2.6 含量測定。精密稱取樣品適量（約相當(dāng)于聯(lián)苯乙酸4mg），加流動相溶解并定量稀釋至100mL量瓶中，搖勻；精密量取5mL，置于50mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液；取聯(lián)苯乙酸對照品適量，加流動相溶解制備成4μg·mL－1溶液，作為對照品溶液；另取樣品和鄰苯基苯甲酸對照品適量，加流動相制備成濃度均為4μg·mL－1的混合溶液，作為分離度測定溶液。取分離度測定溶液適量進(jìn)樣，記錄色譜峰，計算2個主峰之間的分離度，分離度不得小于3，否則試驗(yàn)無效。精密量取對照品溶液和供試品溶液各20μL進(jìn)樣，記錄色譜峰，按外標(biāo)法以峰面積計算含量，結(jié)果3批樣品平均含量分別為100.30%、98.32%、100.40%。

3 論

聯(lián)苯乙酸對照品溶液在254nm波長處有最大吸收，且空白基質(zhì)在此處無干擾，故選254nm為其含量測定波長。

因本品結(jié)構(gòu)簡單，故選擇通用的反相高效液相色譜法檢測有關(guān)物質(zhì)和含量。流動相中的冰醋酸主要起緩沖和改善分離的作用，既可提高方法的重復(fù)性，又可以改善峰形和分離情況，亦可防止聯(lián)苯乙酸在分離過程中的解離和降解。

筆者曾經(jīng)嘗試過多種品牌的、不同長度的十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果分析效果均比較好。但是系統(tǒng)適用性試驗(yàn)仍然是非常必要的，如果鄰苯基苯甲酸與聯(lián)苯乙酸的分離度不足3，則很有可能導(dǎo)致有關(guān)物質(zhì)測定時未知雜質(zhì)之間的分離度小于1.5。

經(jīng)過詳細(xì)的方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果表明，本方法簡便快速、重復(fù)性好，可用于控制聯(lián)苯乙酸凝膠的質(zhì)量。

[1] 佚 名.聯(lián)苯乙酸凝膠劑、搽劑（3.1類）[J].中國醫(yī)藥技術(shù)與市場，2006，6（2）：46.

[2] 劉亞楠，王 偉.高效液相色譜法測定聯(lián)苯乙酸原料及其制劑的有關(guān)物質(zhì)[J].華夏醫(yī)學(xué)，2010，23（4）：375.

Content Determination of Felbinac Gel and Related Substances by HPLC

WANG Ping，ZHANG Jun-bing，WU Hui-bin，NIE Hong-mei（Henan Lingrui Pharmaceutical Co.，Ltd.，Henan Xinxian 465550，China）
WANG Ping，ZHANG Jun-bing，WU Hui-bin，NIE Hong-mei（Beijing Lingrui Weiye Technology Co.，Ltd.，Beijing 100070，China）

OBJECTIVE：To determine the contents of Felbinac gel and related substance.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Kromasil C18with mobile phase consisted of methanol-0.1%glacial acetic acid（65∶35）at the flow rate of 1.0mL·min－1.The detection wavelength was set at 254nm.RESULTS：The linear range of felbinac was 0.3～60μg·mL－1（r＝0.9998），and average recoveries were 100.3%，101.2%，99.8%at low，medium and high concentrations（RSD＝0.24%，n＝9）.The contents of main component and impurity in 3batches of samples were in line with the requirements of limit.CONCLUSION：The method is simple，rapid and reproducible，and it can be used for the quality control of Felbinac gel.

Felbinac gel；Related substances；Content；HPLC

R927.2；R971+.1

A

1001-0408（2012）33-3142-02

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2012.33.28

＊主管藥師。研究方向：藥理學(xué)。電話：010-82614159。E-mail：funnyping@sina.com

2012-01-18

2012-05-20）