全硫代反義hTR對人子宮內膜癌細胞生長的抑制作用

夏麗娟 李洪秀 李德華

在多數人類原發惡性腫瘤中，85%以上發現有端粒酶活性，但在人正常細胞(除生殖細胞、淋巴細胞和造血干細胞外)則為陰性［1］。設計互補于hTR模板區的反義寡核苷酸封閉該模板區，就可抑制端粒酶合成端粒，從而使細胞退出增殖周期，達到治療腫瘤的目的，本研究將端粒酶PS-ASODN經lipotap脂質體轉染作用于子宮內膜癌細胞系HEC-1A，觀察其對子宮內膜癌細胞端粒酶活性的影響，同時檢測其對子宮內膜癌細胞的生長抑制作用，旨在探討PS-ASODN對子宮內膜癌的治療價值，為臨床治療子宮內膜癌提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞 人HEC-1A子宮內膜癌細胞。

2 方法

2.1 實驗分組 本實驗共分六組，不予正、反義核酸及脂質體的空白對照組，脂質體對照組，1.5 μM端粒酶PS-SODN組和濃度分別為0.5 μM、1.0 μM、1.5 μM 的 PS-ASODN 組。形態學檢測和流式細胞儀均采用1.5 μM PS-ASODN。

2.2 實驗方法

2.2.1 細胞培養 子宮內膜癌細胞株HEC-1A采用含10%小牛血清的DMEM培養液，在37℃、飽和濕度、含體積分數為5%的CO2培養箱中培養，1～2 d換一次培養液，細胞鋪滿瓶底70%～80%傳代。0.25%的胰蛋白酶分離消化細胞，實驗取對數生長期細胞。

2.2.2 MTT檢測細胞活性 取各實驗組HEC-1A細胞以5×104個/ml濃度接種在96孔板，每孔100 μl，待對數生長期時，實驗組分別加入終濃度為 0.5、1.0與 1.5 μM 的 PSASODN，脂質體組加含脂質體的DMEM培養液，對照組加入濃度為1.5 μM的端粒酶PS-SODN，空白對照組僅加DMEM培養液，每組設4個復孔。在全自動酶標儀讀取波長570 nm處OD值，計算細胞生長抑制率。

2.2.3 端粒酶活性檢測 分別收集各組細胞(約1×106個)，在反應板中分別加入50 μl陰性對照、50 μl陽性對照，50 μl標準液和50 μl各實驗組的端粒酶提取物于相應反應板孔中。酶標儀上讀取450 nm處OD值。Index=樣品的OD值/標準液的OD值。

3 統計學方法

4 結果

4.1 PS-ASODN作用后子宮內膜癌細胞的增殖 如表1顯示，端粒酶PS-ASODN組HEC-1A子宮內膜癌細胞增殖減慢，0.5 μM PS-ASODN 組細胞尚能緩慢增殖，1.0 μM PS-ASODN組細胞基本無明顯增殖，在48 h到72 h時間段，細胞增殖尤為緩慢。端粒酶PS-SODN組、空白對照組和脂質體對照組HEC-1A細胞隨培養時間延長呈指數增長，不受藥物影響。

4.2 子宮內膜癌細胞端粒酶活性檢測結果 各組細胞轉染不同濃度的端粒酶PS-ASODN后，不同時間的端粒酶活性見表2。各濃度組48 h時端粒酶皆表現為陰性，表明PS-ASODN能夠抑制端粒酶活性。

表1 各實驗組HEC-1A子宮內膜癌細胞體外增殖變化，(A值，，n=4)

表1 各實驗組HEC-1A子宮內膜癌細胞體外增殖變化，(A值，，n=4)

注:t檢驗，各組與對應的空白對照組比較，△P＞0.05、*P＜0.05、＊＊P＜0.01

實驗分組0.017脂質體對照 0.256±0.005△ 0.613±0.013△ 0.752±0.013△ 0.793±0.012△PS-SODN 0.252±0.015△ 0.610±0.014△ 0.744±0.020△ 0.777±0.018△0.5 μM PS-ASODN 0.238±0.009* 0.429±0.012* 0.474±0.009＊＊ 0.564±0.011＊＊1.0 μM PS-ASODN 0.228±0.014* 0.380±0.020＊＊ 0.3798±0.011＊＊ 0.485±0.013＊＊1.5 μMPS-ASODN 0.213±0.020* 0.324±0.022＊＊ 0.310±0.022＊＊ 0.392±0.013 24 h 48 h 72 h 96 h空白對照 0.261±0.012 0.628±0.010 0.769±0.021 0.807±＊＊

表2 端粒酶PS-ASODN對HEC-1A子宮內膜癌細胞端粒酶活性的影響(，n=4)

表2 端粒酶PS-ASODN對HEC-1A子宮內膜癌細胞端粒酶活性的影響(，n=4)

注:index≥1為+index在0.91～0.99之間為+/-index≤0.90為-

實驗分組培養時間0.047 PS-SODN組 1.296±0.023 1.214±0.039 1.323±0.035 1.317±0.025脂質體對照 1.278±0.045 1.282±0.045 1.327±0.028 1.356±0.036 0.5 μM PS-ASODN 0.988±0.039 0.878±0.022 0.718±0.023 0.762±0.019 1.0 μM PS-ASODN 0.848±0.055 0.817±0.014 0.766±0.014 0.769±0.016 1.5 μM PS-ASODN 0.740±0.025 0.717±0.025 0.696±0.24 h 48 h 72 h 96 h空白對照 1.373±0.036 1.146±0.027 1.269±0.030 1.291±016 0.760±0.032

5 討論

應用封閉人端粒酶RNA為靶序列的反義寡核苷酸在體內外能明顯抑制癌細胞中的端粒酶活性及細胞的增殖［2］，早在1995年，Feng等就用反義hTR轉染HeLa細胞，發現細胞中端粒酶活性明顯降低，端粒縮短［3］。國內學者用端粒酶反義核酸進行體外試驗發現能抑制多種癌細胞的端粒酶活性［4］。此點在本研究同樣得到了證實，我們的結果顯示子宮內膜癌細胞株HEC-1A細胞中端粒酶活性呈陽性表達，經端粒酶PS-ASODN作用后HEC-1A細胞端粒酶活性受到抑制。而端粒酶PS-SODN對HEC-1A細胞的端粒酶無抑制作用。提示PS-ASODN對細胞端粒酶活性的抑制作用是序列特異性的。

［1］Zamaratski E，Pradeepkumar PI，Chattopadhyaya J.A critical survey of the structure-function of the antisense oligo/RNA heteroduplex as substrate for RNAse H.J Biochenm Biophys Methods，2001，28，48(3):189-208.

［2］Greider CW，Blackburn EH.Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts.Cell，1985，43:405-413.

［3］Feng RH，Zhu ZG，Li JF，et al.Inhibition of human telomerase in MKN-45 cell line by antisense hTR expression vector induces cell apoptosis and growth arrest.World J Gastroenterol，2002，8(3):436-400.

［4］MandalM，kumarR，et al.Bcl-2 modulatestelomeraseactevity.Biolchem，2004，272(22):14183.