芡實提取物對衰老小鼠腦組織p53蛋白表達的影響及機制

沈 蓓 吳啟南 伍城穎 王新勝 賀瀟瀟 陳廣云 (南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210046)

芡實提取物對衰老小鼠腦組織p53蛋白表達的影響及機制

沈 蓓 吳啟南 伍城穎 王新勝 賀瀟瀟 陳廣云 (南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210046)

目的 觀察芡實提取物對D-半乳糖(D-gal)致衰老小鼠氧化系統指標及p53蛋白表達的影響，探討芡實提取物延緩衰老的機制。方法 104只昆明雄性小鼠隨機分為正常對照組，D-gal模型組，芡實乙醇提取物高、低劑量組，芡實乙酸乙酯提取物高、低劑量組，芡實正丁醇提取物高、低劑量組。各組用相應藥物連續處理6 w。用比色法檢測小鼠腦組織總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性。用HE染色法和免疫組織化學染色法檢測小鼠腦組織海馬區細胞形態和p53蛋白表達水平。結果 芡實提取物能有效提高衰老小鼠腦組織T-AOC、SOD和GSH-Px水平(P＜0.05，P＜0.01)，降低MDA含量(P＜0.05，P＜0.01)，且呈量效依賴關系，還能改善海馬區神經細胞受損狀態，下調p53蛋白的表達(P＜0.05)。結論 芡實提取物可下調p53蛋白的表達，其機制可能與清除自由基及改善腦組織海馬區神經細胞受損情況有關。

芡實提取物;抗氧化;p53蛋白

p53屬于腫瘤壞死基因/神經生長因子受體家族，其表達產物具有傳遞凋亡信號的作用，因此本實驗選擇該基因作為主要參考指標來研究芡實延緩衰老的作用。芡實為睡蓮科水生植物芡的干燥成熟種仁，具有益腎固精、補脾止瀉、延緩衰老的功效，已有較多研究報道，芡實水和乙醇提取物具有抗氧化〔1〕、抗心肌缺血〔2〕及輔助治療腦卒中后遺癥〔3〕等作用，這說明芡實在心腦血管疾病治療方面有著潛在的可研究價值，但迄今為止，尚未見芡實及其提取物在這方面的報道。為此，本文以腹腔注射D-半乳糖的方法建立小鼠腦衰老模型進行上述研究，以評價芡實幾種提取物在延緩腦衰老方面的作用及其影響機制。

1 材料與方法

1.1 芡實提取物的制備

乙醇提取物：稱取干燥芡實，用8倍量80%乙醇，回流提取2次，每次8 h，合并提取液，減壓濃縮為浸膏，即得。乙酸乙酯提取物：同法先制備上述乙醇提取物，減壓濃縮后得到的浸膏用水混懸，以少量多次原則，乙酸乙酯萃取6次，合并萃取液，回收乙酸乙酯層，減壓濃縮為浸膏，即得。正丁醇提取物：稱取干燥芡實，用8倍量水飽和正丁醇，回流提取2次，每次8 h，合并提取液，減壓濃縮為浸膏，即得。芡實購于北京中葛綠元科技有限公司，經南京中醫藥大學藥學院中藥鑒定教研室吳啟南教授鑒定為為睡蓮科植物芡Euryale ferox Salisb.的成熟種仁。

1.2 藥品與試劑

AOC)、虧氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所);p53單克隆抗體和免疫組化SABC試劑盒(美國Zymed公司);DAB顯色劑(北京中山生物技術公司);多聚甲醛生化試劑(Sigma公司)。

1.3 動物

清潔級昆明種小鼠104只，雄性，體質量18～22 g，由江蘇大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(蘇)2009-0002。

1.4 儀器

FSH-2A可調高速電動勻漿機(金壇市金南儀器廠);LXJ-ⅡB低速大容量多管離心機(南京曉曉儀器設備有限公司);Powerwave X340全波長酶標儀(美國Bio-Tek公司);Yamato Kohki切片機(日本大和光機械工業株式會社);BX51TRF型顯微鏡(日本Olympus Optical公司);Eclipse E200型顯微鏡(日本Nikon公司);IPP顯微鏡圖像分析軟件(美國MEDIA CYBERNETICS公司)。

1.5 方法

1.5.1 建模與給藥 小鼠適應性喂養1 w后按體重隨機分為8組，每組13只，分別為正常對照組，模型組，芡實乙醇提取物高、低劑量組(500、250 mg·kg-1·d-1)、芡實乙酸乙酯提取物高、低劑量組(300、150 mg·kg-1·d-1)、芡實正丁醇提取物高、低劑量組(100、50 mg·kg-1·d-1)，以上三種提取物高、低劑量分別換算成生藥量是相一致的。模型組和給藥組每日上

D-半乳糖(Sigma公司);總抗氧化能力(T-午腹腔注射D-半乳糖500 mg·kg-1·d-1，正常對照組腹腔注射等量生理鹽水，下午給藥組分別灌胃相應濃度的藥物，正常對照組和模型組分別灌胃等量生理鹽水，給藥量均為0.1 ml/10 g，連續42 d〔4〕，42 d后進行生化指標檢測和組織學考察。

1.5.2 免疫組織化學檢測 給藥結束后，斷頭，冰盤上迅速取小鼠大腦，4%多聚甲醛固定，石蠟切片常規脫蠟至水，3%H2O2孵育，正常牛血清封閉，順序滴加一抗p53單克隆抗體(滴度1∶80)、羊抗鼠二抗、鏈霉親和素-生物素-酶復合物(SABC)液，DAB顯色劑。復染，脫水，透明，封片后顯微鏡觀察。分析單位視野下，陽性區域所占的百分數。

1.5.3 生化指標檢測 給藥結束后，斷頭，冰盤上迅速取小鼠大腦，預冷生理鹽水沖洗表面血液，濾紙吸干。用勻漿機加預冷生理鹽水研磨制成10%的腦組織勻漿，3 500 r/min低溫離心10 min，取上清。按各試劑盒說明檢測小鼠腦組織中T-AOC、SOD、MDA、GSH-Px及蛋白質含量。取小鼠大腦置10%甲醛溶液中固定，制備病理組織切片，HE染色，對大腦皮層海馬進行組織學觀察。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 一般情況觀察

正常對照組和芡實提取物組小鼠毛發光亮而濃密、皮膚富有彈性。與正常對照組小鼠相比，模型組小鼠6 w后出現衰老跡象：毛發稀疏、行動遲緩、飲食量減少、皮膚松弛、彈性下降等。

2.2 免疫組化染色結果

p53蛋白陽性表達為細胞的胞質內或核膜上出現棕黃色或棕褐色顆粒。與正常對照組相比，模型組p53蛋白表達明顯升高(P＜0.05)。與模型組相比，芡實乙醇提取物高劑量組和芡實正丁醇提取物高、低劑量組p53蛋白表達明顯降低(P＜0.05)，其余各組p53蛋白表達雖有所降低，但無統計學差異(見表1)。

2.3 對衰老模型小鼠腦T-AOC、SOD、MDA、GSH-Px的影響

與正常對照組相比，模型組小鼠腦組織T-AOC、SOD、GSH-Px含量明顯降低(P＜0.01)，MDA含量明顯升高(P＜0.01)。各給藥組均能有效提高衰老小鼠腦組織T-AOC、SOD和GSH-Px含量(P＜0.05，P＜0.01)，同時顯著降低 MDA 含量(P＜0.01)，效果相當，正丁醇提取物略顯優勢(見表1)。

表1 對衰老模型小鼠腦組織T-AOC、SOD、MDA、GSH-Px、p53蛋白表達陽性面積比例的影響(s，n=13)

表1 對衰老模型小鼠腦組織T-AOC、SOD、MDA、GSH-Px、p53蛋白表達陽性面積比例的影響(s，n=13)

與正常對照組比較：1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;與模型組比較：3)P ＜0.05，4)P ＜0.01

組別 劑量(mg/kg)T-AOC(U/mgprot)SOD(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot)GSH-Px(U/mgprot)p53陽性面積(%)正常對照組 - 2.16±0.47 50.31±3.414) 4.27±0.744) 39.31±3.604) 0.25±0.173)模型組 - 1.56±0.06 38.87±1.572) 6.30±0.582) 30.47±1.622) 3.58±0.911)乙醇提取物高劑量組 500 1.87±0.21 44.67±2.703) 3.69±0.424) 40.04±1.494) 0.28±0.193)乙醇提取物低劑量組 250 1.67±0.23 43.64±5.65 4.14±0.114) 37.11±2.924) 0.87±0.11乙酸乙酯提取物高劑量組300 1.72±0.14 41.18±1.781) 3.75乙酸乙酯提取物低劑量組150 1.64±0.17 40.39±4.021) 4.25±0.134) 32.83±1.101) 0.99±0.71正丁醇提取物高劑量組 100 1.82±0.064) 45.69±3.623) 3.45±0.064) 51.16±1.462)4) 0.20±0.113)正丁醇提取物低劑量組 50 1.79±0.123) 42.34±1.541) 4.04±0.334) 40.89±0.674) 0.31±0.073)

2.4 對衰老模型小鼠海馬細胞形態學的影響

經HE染色后，光學顯微鏡下正常細胞核呈均一淡藍色或藍色，胞質呈淡紅色，胞膜完整連續。異常組織則細胞變圓變小，胞核固縮、碎裂，出現局部深染，不均勻，或者核分散消失而不見核染色。正常對照組海馬區細胞排列整齊，層次緊密，形態完整，細胞邊緣清晰，染色均勻，核仁深染;模型組細胞數量較少，細胞間隙增長，排列疏松不齊，大部分細胞核仁淺染，染色質不均勻，少量神經細胞的圓形胞核體

組織石蠟切片積減小，固縮，有的甚至消失、核膜皺縮;芡實乙醇提取物高、低劑量組與正常對照組和模型組相比，細胞數量增多，大部分細胞形態完整，細胞邊緣清晰，染色質均勻，核仁深染。芡實乙酸乙酯提取物高、低劑量組：與模型組相比，細胞數量增多，但與正常組相比，細胞數目有所減少，大部分細胞排列整齊，層次緊密，核仁深染;芡實正丁醇提取物高、低劑量組：與正常組和模型組相比，細胞數量增多，細胞排列整齊，層次緊密，核仁深染 (見圖1)。

圖1 各組小鼠海馬區細胞形態學的改變(HE，×200)

3 討論

與其他幾種衰老動物模型相比，D-半乳糖衰老動物模型造模方法簡便易行，價格低廉，結果穩定，已成為國內公認的衰老動物模型，在抗衰老藥物研究等領域得到廣泛應用。D-半乳糖致衰老的作用機制為：一方面，半乳糖在其氧化酶的作用下，氧參與反應，生成二醛糖及H2O2，且半乳糖在體內亦可發生非酶糖基化反應，產生蛋白質交聯;另一方面，半乳糖在醛糖還原酶的催化下還原成半乳糖醇，該物質不能被細胞進一步代謝而堆積在細胞內，影響正常滲透壓，導致細胞腫脹和功能障礙，最終引起衰老〔5〕。

近年來的研究表明，基因p53與細胞凋亡有密切關系。p53基因是一種重要的抑癌基因，編碼393個氨基酸組成的含磷蛋白質。體外實驗和動物實驗證實，神經細胞發生凋亡時，伴隨著p53基因的高水平表達。p53一般通過3個步驟造成細胞凋亡：①通過轉錄誘發氧化還原基因;②制造活性氧因子;③氧化破壞線粒體的細胞膜，使細胞死亡。本實驗結果顯示D-半乳糖致衰老小鼠腦組織海馬區細胞數量較少，出現異常細胞，呈現凋亡特征;促凋亡基因p53蛋白顯著表達。而幾種芡實提取物能明顯抑制海馬神經細胞的凋亡，減少促凋亡基因p53蛋白的表達，甚至達到正常水平。這進一步從病理學角度提供了芡實能夠改善D-半乳糖致小鼠腦衰老情況的證據。

自由基理論是衰老的基本理論，大量實驗表明衰老尤其是中樞神經系統的衰老大部分與自由基及其中間產物的毒性有關。實際上，衰老過程與自由基的過量生成及它們的濃度與抗氧化系統的平衡密切相關。在正常生理條件下，自由基及其中間產物的產生(如 MDA、NO等)與抗氧化系統(如SOD、GSH等)保持著一定的平衡，但是，隨著衰老過程的進程，這個平衡被打破，以至于活性氧大量產生，抗氧化系統逐漸減弱。芡實中含有大量黃酮〔6〕類強抗氧化劑，從而能夠消除體內過量自由基，避免生物大分子的損傷。本實驗結果表明，D-半乳糖致衰老小鼠腦組織中MDA含量顯著高于正常小鼠，T-AOC、SOD、GSH-Px活性顯著低于正常小鼠。但是，給予一定劑量芡實各提取物后，小鼠腦組織中自由基中間產物MDA的含量顯著減少，能顯著提高抗氧化系統相關酶SOD、GSH-Px的活性，起到延緩衰老的作用。其中，就芡實幾種提取物對抗氧化系統這幾個指標的影響來看，對GSH-Px活性的增強效果最佳。

綜上所述，所有研究結果證實D-半乳糖能導致小鼠呈現衰老跡象，產生一系列應激反應，促進自由基的形成、引起神經細胞凋亡和退化，最終導致小鼠衰老。而給以一定劑量的芡實提取物，能減少促凋亡基因p53蛋白的表達，并通過降低腦組織中MDA含量，同時提高T-AOC、SOD和GSH-Px的活性及抑制神經細胞凋亡發揮其延緩腦衰老的功效。其中正丁醇提取物高、低兩個劑量對所有不良反應的改善效果最佳。雖然幾種芡實提取物不能同時很好地改善D-半乳糖引起的所有指標的變化，但從影響腦組織中某些相關生化指標的結果，也能看出其改善腦衰老情況的作用，進一步的機制研究仍在進行中。

1 劉玉鵬，劉 梅，劉俊英，等.30種中草藥的抗氧化活性研究〔J〕.煙臺大學學報，2000;13(1)：70-3.

2 Samarjit D，Eter D，Utpal R.The effect of Euryale ferox(makhana)，an herb of aquatic origin，on myocardial ischemicreperfusion injury〔J〕.Mol Cell Biochem，2006;289：55-63.

3 王婉鋼，張曉平，古 青，等.芡實對中風后遺癥康復的影響〔J〕.湖北中醫雜志，2010;32(2)：16-7.

4 朱亞珍，朱虹光.D-半乳糖致衰老動物模型的建立及其檢測方法〔J〕.復旦學報(醫學版)，2007;34(4)：617-9.

5 李文彬，韋 豐，范 朋，等.D-半乳糖在小鼠上誘導的擬腦老化效應〔J〕.中國藥理學與毒理學雜志，1995;9(2)：93-5.

6 李美紅，楊雪瓊，萬直劍，等.芡實的化學成分〔J〕.中國天然藥物，2007;5(1)：24-6.

Effect and mechanisms of Euryale ferox seed extracts on the expression of p53 protein in the brain of aging mice

SHEN Bei，WU Qi-Nan，WU Cheng-Ying，et al.
Pharmaceutical College of Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210046，Jiangsu，China

Objective To investigate the deferring aging effect and the associated mechanisms of Euryale ferox seed extracts on indexes of oxidation system and the expression of p53 protein in the brain of aging mice induced by D-gal.Methods 104 male Kunming mice were divided randomly into the normal control，D-gal model，high and low dose of ethanol，acetic ester and n-butanol extracts from Euryale ferox seed groups.All animals were administered by corresponding medicine for 6 weeks.The activities of total antioxidant capacity(TAOC)，superoxide dismutase(SOD)，glutathione peroxidase(GSH-Px)and malondialdehyde(MDA)in brain were detected.HE stain and immunohistochemistry techniques were performed to determine the form of hippocampal nerve cells and the expression of p53 protein in the brain choroid.Results Compared with the model group，Euryale ferox seed extracts could increase the activities of T-AOC，SOD and GSH-Px(P ＜0.05，P ＜0.01)，reduce MDA(P ＜ 0.05，P ＜0.01)with dose-dependent tendency，prevent hippocampal nerve cells from damaging obviously and down-regulate the expression of p53 protein(P＜0.05).Conclusions Euryale ferox seed extracts can down-regulate the expression of p53 protein.The mechanisms may be related to scavenging free radicals and preventing hippocampal nerve cells from damaging.

Euryale ferox seed extracts;Aging mice;Antioxidant;p53 protein

R394

A

1005-9202(2012)23-5156-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.027

國家十二五支撐計劃項目(No.2011BAI04B06);江蘇省高校中藥資源與化學研究科技創新團隊(2011);江蘇省六大人才高峰項目(2009)

吳啟南(1963-)，男，教授，博士生導師，主要從事中藥品質評價研究。

沈 蓓(1988-)，女，在讀碩士，主要從事中藥品質評價研究。

〔2012-07-19收稿 2012-10-10修回〕

(編輯 曹夢園)