SH-SY5Y細胞α7尼古丁受體基因抑制對APP代謝的影響

王 凡 任家謀 齊曉嵐 劉 健 官志忠

(貴陽醫學院病理學教研室及附院病理科，貴州 貴陽 550004)

SH-SY5Y細胞α7尼古丁受體基因抑制對APP代謝的影響

王 凡1任家謀2齊曉嵐2劉 健1官志忠1

(貴陽醫學院病理學教研室及附院病理科，貴州 貴陽 550004)

目的 采用RNA干擾技術抑制神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y細胞)中α7神經型尼古丁乙酰膽堿受體(nAChR)基因表達，了解對β淀粉樣前體蛋白(APP)代謝中的γ-分泌酶兩個重要組分早老蛋白(PS)及單過性跨膜蛋白(NCT)水平的影響。方法 SH-SY5Y細胞轉染針對α7 nAChR的小干擾RNA(siRNA)，用實時PCR法和Western印跡法分別測定細胞中α7 nAChR、PS及NCT在mRNA和蛋白表達水平的變化。結果 轉染α7 nAChR siRNA后，與對照組相比，α7 nAChR mRNA及蛋白表達水平明顯降低;PS蛋白mRNA及蛋白水平均升高，而NCT水平無明顯變化。結論 α7 nAChR基因表達抑制后γ-分泌酶組分之一PS的水平明顯升高，這種改變可能與α7 nAChR基因表達抑制后β-淀粉樣蛋白(Aβ)的產生增多有關，可能與阿爾茨海默氏病(AD)的發病有一定的關系。

α7尼古丁乙酰膽堿受體;γ-分泌酶;早老蛋白;單過性跨膜蛋白

神經型尼古丁乙酰膽堿受體(nAChR)在AD的發病機制中起著重要作用，在APPSWE轉基因大鼠腦標本中可見α7 nAChR的選擇性升高，提示α7 nAChR的升高是對Aβ毒性作用的一種保護機制。RNA干擾(RNAi)是通過具有一定結構特點的小干擾RNA(siRNA)，導入哺乳動物細胞后，促使同源性mRNA分子特異性降解同時可抑制其翻譯，誘使細胞表現出特定基因缺失的表型的過程〔1〕。本研究用RNAi技術抑制SHSY5Y細胞α7 nAChR的表達，研究其受抑制后β淀粉樣前體蛋白(APP)代謝的關鍵酶γ-分泌酶兩個主要組成部分早老蛋白(PS)及單過性跨膜蛋白(NCT)表達水平的變化，從而探討α7 nAChR在AD發病中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

源于人腦的SH-SY5Y細胞由本課題組保存;DMEM培養基、胎牛血清、0.25%胰酶購于Hyclone公司;鼠抗人α7 nAChR單克隆抗體(sc-65865)，鼠抗人NCT單克隆抗體(sc-136003)，鼠抗人PS-1單克隆抗體(sc-365495)及辣根過氧化物酶(HRP)標記的驢抗鼠二抗(sc-2314)、α7 nAChR siRNA(sc-42532)、siRNA陰性對照(sc-37007)、siRNA熒光質控(sc-36869)、siRNA轉染試劑(sc-29528)、siRNA轉染培養基(sc-36868)均購于Santa Cruz公司;Oligo dT、dNTP購于上海生工公司;Trizol試劑購于Invitrogen公司;M-MLV逆轉錄酶購于Promega公司;RNA酶抑制劑購于Toyobo公司;Syber-green 2×PCR Mix購于Roche公司;鼠抗人β-actin單克隆抗體(A-1987)購于Sigma公司;聚乙烯二氟(PVDF)膜、ECL-Plus發光試劑、高效顯影膠片購于Amersham公司;顯影液、定影液購于柯達公司;細胞裂解液購于碧云天公司，普通化學試劑均購于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 SH-SY5Y細胞常規培養，培養液為DMEM，添加15%胎牛血清、1%雙抗 (青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml)培養箱中含5%CO2，溫度為37℃。細胞分組為空白對照組、陰性對照組、轉染 α7 nAChR siRNA即RNA干擾組，每組設3個復孔，重復3次。

1.2.2 siRNA的轉染 生長良好的細胞用0.25%胰蛋白酶消化傳入六孔細胞培養板中，待其匯合度達80%時按Santa Cruz公司轉染說明書按不同比例進行轉染siRNA熒光質控，根據熒光值摸索和優化siRNA的轉染條件。再分別轉染α7 nAChR siRNA、siRNA陰性對照，轉染后6小時換正常培養基繼續培養48 h后收集細胞，并設未轉染組作為空白對照，每組均設3個復孔，重復3次。

1.2.3 實時PCR檢測mRNA水平 采用Trizol一步法提取細胞總RNA。將mRNA逆轉錄反應生成cDNA。以逆轉錄產物為模板進行 Real-time PCR，采用 Syber green法測定。α7 nAChR、PS-1、NCT和內對照 β-actin引物序列見表 1，ABI Step One plus型熒光定量PCR儀采集待測基因及內對照β-actin擴增各循環熒光信號，以Applied Biosystems SDS1.4軟件進行熒光采集和數據分析。SDS1.4軟件分析其△△Ct值及RQ值，RQ=2-△△Ct。分析實驗結果時以β-actin為內對照，計算各基因在實驗組與對照組的相對水平。

表1 熒光定量PCR引物序列及產物片段

1.2.4 蛋白表達水平的測定 收集細胞，提取細胞蛋白并定量，用Western印跡方法檢測α7 nAChR、PS-1及NCT蛋白表達水平。以β-actin作為內對照。以Labworks軟件分析結果時以β-actin蛋白條帶作為內對照，計算α7 nAChR、PS-1及NCT蛋白條帶與β-actin蛋白條帶像素灰度的百分比值作為蛋白表達的相對水平。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 轉染α7 nAChR siRNA后α7 nAChR mRNA及蛋白表達水平

轉染α7 nAChR siRNA后SH-SY5Y細胞α7 nAChR mRNA(表2)水平和蛋白(表3，圖1)表達明顯降低，與對照組相比差異有高度統計學意義(P＜0.01)，轉染陰性對照與對照組相比無差異。說明已將α7 nAChR siRNA轉入SH-SY5Y細胞，且抑制了α7 nAChR mRNA和蛋白水平的表達。

2.2 轉染α7 nAChR siRNA后對γ-分泌酶主要組分PS-1及NCT mRNA及蛋白表達水平

轉染 α7 nAChR siRNA后SHSY5Y細胞PS-1 mRNA及蛋白水平分別升高了87%和76%，與對照組及轉染陰性對照組相比差異有高度統計學意義(P＜0.01);而轉染α7 nAChR siRNA后SH-SY5Y細胞NCT mRNA及蛋白水平與對照組及轉染陰性對照組相比差異無高度統計學意義(P＞0.05)。說明下調α7 nAChR水平能使γ-分泌酶的主要組分PS-1表達水平升高，從而增加γ-分泌酶對APP的切割。見表2，表3，圖2。

表2 轉染α7 nAChR siRNA后α7 nAChR，PS-1及NCT mRNA表達s，n=9)

表2 轉染α7 nAChR siRNA后α7 nAChR，PS-1及NCT mRNA表達s，n=9)

與對照組比較：1)P＜0.01，下表同

組別 β-actin Ct值 目的基因Ct值 2-△△ct α7 nAChR 對照組22.128±0.30 27.286±0.39 1.00陰性對照組 21.224±0.34 27.458±0.41 0.95 α7 siRNA組 21.093±0.27 29.146±0.53 0.271)PS-1 對照組 22.128±0.30 21.928±0.27 1.00陰性對照組 21.224±0.34 22.051±0.41 0.98 a7 siRNA組 21.093±0.27 20.986±0.24 1.871)NCT 對照組 22.128±0.30 19.65±0.23 1.00陰性對照 21.224±0.34 19.82±0.27 0.95 α7 siRNA組21.093±0.27 19.66±0.30 0.97

表3 轉染α7 nAChR siRNA后a7 nAChR，PS-1及NCT蛋白表達(s，n=9，%)

表3 轉染α7 nAChR siRNA后a7 nAChR，PS-1及NCT蛋白表達(s，n=9，%)

蛋白名稱 對照組 陰性對照組 RNA 干擾組α7 nAChR 100.0 99.7±7.81 9.3±0.61)PS-1 100.0 97.8±4.0 182.3±7.11)NCT 100.0 98.2±5.29 7.4±4.5

圖1 轉染α7 nAChR siRNA后α7 nAChR蛋白表達

圖2 轉染α7 nAChR siRNA后PS-1及NCT蛋白表達

3 討論

RNAi能通過轉錄后基因沉默機制(PTGS)特異性抑制基因表達〔1〕。目前RNAi技術已廣泛用于功能基因組學、基因治療學、新的藥物開發等眾多領域〔2〕。

nAChR與大腦學習記憶、智力發育和識別能力等腦功能有關，還調節多種受體的功能，并具有對抗細胞毒素性神經保護作用，其減少與AD的發生有關。大量研究報道AD病人腦中，膽堿能系統嚴重受損，與對照組相比，AD病人腦中高親和力尼古丁受體明顯下降〔3〕。研究證實，nAChR與認知功能呈顯著的正相關，在疾病發生的早期即出現特異性的nAChR減少〔4〕。α7 nAChR作為nAChR中重要的成員，其在APPSWE轉基因大鼠腦標本中選擇性升高，提示α7 nAChR的升高是對Aβ毒性作用的一種保護機制，在調節神經可塑性方面具有獨特的作用〔5〕。在APPSWE轉基因大鼠腦標本中可見α7 nAChR的選擇性升高，也提示α7 nAChR的升高是對Aβ毒性作用的一種保護機制。本研究將針對α7 nAChR的siRNA片段轉染到SHSY5Y細胞中，mRNA和蛋白表達水平明顯下降了。表明α7 nAChR siRNA能有效地抑制內源性α7 nAChR的表達。PS是γ-分泌酶的核心部分，是γ-分泌酶活性所必需的，有研究發現PS的異二聚體和NCT都特異性地結合γ-分泌酶抑制劑并且和γ-分泌酶活性有關，表明NCT也是影響γ-分泌酶的活性因素。抑制NCT表達，會導致減少PS的CTF形成和APH-1和PEN-2的表達，增加APP的C端片段，減少Aβ的生成。

我們前期的研究表明，通過RNAi方法選擇性下調SHSY5Y細胞中α7 nAChR的表達能使細胞Aβ生成增多，這可能與受體表達抑制后β-分泌酶BACE1的表達增加，增加βAPPs的生成有關。此次我們針對APP代謝中另一種重要的酶γ-分泌酶的重要組分進行了研究。α7 nAChR基因表達抑制能明顯增加γ-分泌酶組分PS-1mRNA及蛋白水平的表達，γ-分泌酶水平的增加也進一步增加了Aβ的產生與蓄積，這可能是AD發病中Aβ生成增多的機制，另一重要組分NCT的水平未見變化的原因尚需要進一步的研究，這些結果均提示α7 nAChR對AD可能具有重要的神經保護作用。

1 Higashitani A，Hashizume T，Sugimoto T，et al.C.elegans RNAi space experiment(CERISE)in Japanese Experiment Module KIBO〔J〕.Biol Sci Space，2009;23(4)：183-7.

2 Xie Z，Wroblewska L，Prochazka L，et al.Multi-input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells〔J〕.Science，2011;333(6047)：1307-11.

3 Nordberg A.Nicotinic receptor abnormalities of Alzheimer’s disease：therapeutic implications〔J〕.Biol Psychiatry，2001;49(2)：200-10.

4 Dani JA，Bertrand D.Nicotinic acetylcholine receptors and nicotinic cholinergic mechanisms of the central nervous system〔J〕.Ann Rev Pharmacol Toxicol，2007;47(5)：699-729.

5 Toyohara J，Hashimoto K.α7 nicotnic receptor agonists：potential therapeutic drugs for treatment of cognitive impairments in schizophrenia and alzheimer's disease〔J〕.Open Med Chem J，2010;4(1)：37-56.

Influence of inhibiting α7 nicotinic acetylcholine receptor gene expression on the metabolism of APP in SH-SY5Y cells

WANG Fan，REN Jia-Mou，QI Xiao-Lan，et al.
Molecular Biology Laboratory of Guiyang Medical University，Guiyang 550004，Guizhou，China

Objective To investigate the influence of inhibiting α7 neuronal nicotinic acetylcholine receptor(nAChR)by small interference RNA(siRNA)on the level of presenilin(PS)and nicastrin(NCT)，the two components of γ-secretase in SH-SY5Y cells.Methods The siRNA of α7 nAChR was transfected into SH-SY5Y cells，and the expressions of α7 nAChR，PS and NCT mRNA and protein were detected by real-time PCR and Western blotting respectively.Results Compared with controls，the mRNA and protein levels of α7 nAChR in the SH-SY5Y cells transfected with the α7 nAChR siRNA were significantly decreased.Expressions of PS mRNA and protein levels were increased，while there was no difference in NCT level.Conclusions The inhibited α7 nAChR mRNA induced by siRNA may obviously increase the level of PS，the main component of γ-secretase，which may connect to the increased production of Aβ induced by the inhibiting of α7 nAChR，and might be connected with the pathogenesis of AD.

α7 nAChR; γ-secretase;Presenilin(PS);Nicastrin(NCT)

R749.1

A

1005-9202(2012)23-5177-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.035

國家自然科學基金資助項目(30960123);貴州省科技廳基金項目黔科合J字2012〔2056〕

1 貴陽醫學院附屬醫院神經外科

2 貴陽醫學院分子生物學重點實驗室

官志忠(1951-)，男，醫學博士，教授，博士生導師，主要從事老年性癡呆發病機制研究。

王 凡(1975-)，男，在讀博士，主要從事神經分子生物學研究。

〔2012-07-12收稿 2012-10-10修回〕

(編輯 曹夢園)