蝦青素對骨關節炎軟骨細胞氧化損傷及炎性的影響

裴凌鵬 白 巖 惠伯棣

(中央民族大學中國少數民族傳統醫學研究院國家民委-教育部重點實驗室，北京 100081)

蝦青素對骨關節炎軟骨細胞氧化損傷及炎性的影響

裴凌鵬 白 巖 惠伯棣1

(中央民族大學中國少數民族傳統醫學研究院國家民委-教育部重點實驗室，北京 100081)

目的 研究蝦青素對骨關節炎(OA)軟骨細胞氧化損傷及炎性的逆轉作用。方法 選擇15只5月齡新西蘭兔，采用內側副韌帶、前后交叉韌帶切斷并切除內側半月板的OA動物模型制作方法，體外分離培養軟骨細胞。以假手術組細胞為正常對照組，造模組細胞為OA軟骨細胞，分別加入10、20、30 μg/ml蝦青素(低、中、高劑量);從第9周開始，每周處死1組動物，分離培養軟骨細胞。連續8 w，DCFH-DA法檢測細胞內活性氧(ROS)水平，Griess法測定培養上清中氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)含量，RT-PCR法檢測各組細胞相關炎性因子(IL)-1β、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、轉錄調節因子p53基因mRNA的表達。結果 DCFH-DA法檢測細胞內ROS水平，對照組與模型組差異顯著(P＜0.01);蝦青素低、中、高劑量組與模型組差異顯著(P＜0.01)。模型組中NaNO2、SOD、GSH-Px與對照組差異顯著(P＜0.01);NaNO2、SOD、GSH-Px水平蝦青素低、中、高劑量組與模型組差異顯著(P＜0.01，P＜0.05)。模型組中IL-1β、iNOS、p53基因mRNA的表達量與對照組及各劑量蝦青素組差異顯著(P＜0.01)。結論 蝦青素對OA軟骨細胞的氧化損傷及炎性有逆轉作用，具有研發成為OA治療藥物的潛能。

蝦青素;骨關節炎;軟骨細胞;氧化損傷;炎性因子

骨關節炎(OA)表現為關節軟骨完整性受損，軟骨下骨板及關節邊緣骨病變，即關節軟骨的退變和繼發性骨質增生。蝦青素(Astaxanthin)，全稱為 3，3-二羥基-β 胡蘿卜素-4，4-酮，是一種含氧的類胡蘿卜素，其分子結構的碳骨架由中央多聚烯鏈和位于兩側的芳香環組成，并在每個芳香環上各有一個酮基(=O)和一個羥基(-OH)。由于其有極強的抗氧化能力，具有抗氧化、防止心血管疾病、提高免疫力、抗癌、抗骨質疏松等多種生物學活性〔1〕。本實驗旨在研究蝦青素對OA軟骨抗氧化損傷及抗炎的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

15只5月齡新西蘭兔，體重(300±25)g，雌雄各半，由軍事醫學科學院動物實驗中心提供(動物合格證號：JXYX-D20110720)。活性氧(ROS)檢測試劑盒、一氧化氮檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱這氧化物酶(GSHPx)檢測試劑盒均為南京建成生物工程公司產品;白介素(IL)-β、腫瘤壞死因子(TNF)-α放免試劑盒為解放軍總醫院放免所產品;低熔點瓊脂為Sigma公司產品;總RNA提取試劑RNAisoTMPlus、逆轉錄試劑盒Prime ScriptTMRT Reagent Kit和 PCR試劑盒TaKaRa TapTM購自寶生物工程(大連)有限公司;蝦青素(純度≥95%)由中央民族大學國家民委-教育部重點實驗室藥化室提供。

1.2 動物分組及動物模型建立

分為正常對照組、模型組、蝦青素低劑量組、蝦青素中劑量組、蝦青素高劑量組，每組3只。兔OA動物模型的建立采用內側副韌帶、前后交叉韌帶切斷并切除內側半月板改良 Hulth法〔2〕。造模組動物用水合氯醛(10%，1 ml/kg)麻醉，仰臥位，四肢固定于自制手術臺上，脫毛，碘伏消毒，鋪無菌洞巾，取雙后膝關節內側橫向切口約1.5 cm，逐層打開關節腔，切斷內側副韌帶，探查關節腔無原發病變后，切斷前交叉韌帶，全部切除內側半月板造模，逐層縫合切口。假手術組動物操作同前，但不切斷前交叉韌帶和內側半月板。術后每天肌注青霉素20萬 U，共1 w，預防感染。術后采用一籠一兔喂養，造模1 w后每日驅趕兔子來回行走約0.5 h。每周制作一組模型，連續8 w。從第9周開始，每周處死一組動物，分離培養軟骨細胞，測定相關指標，連續8 w。正常對照組由假手術動物分離獲得，10%IMDM培養液培養;OA模型分4組，由造模動物分離獲得，模型組10%IMDM正常培養;蝦青素低劑量組加入10 μg/ml蝦青素，中劑量組加入20 μg/ml蝦青素，高劑量組加入30 μg/ml蝦青素。蝦青素用含10%血清IMDM 培養基配制成1 mg/ml的溶液，經0.22 μm微孔濾膜過濾無菌后，逐漸稀釋得到30、20、10 μg/ml的藥液。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 軟骨細胞提取與培養 將新西蘭兔固定，空氣栓塞處死，剝皮暴露膝關節。截取膝關節，粗略修剪后浸入無菌DHank液體中，帶入超凈工作臺，手術刀片取關節表面軟骨，放入10 ml無菌玻璃平皿，倒入D-Hank液掩蓋標本。軟骨切碎約為1 mm×1 mm的小塊，D-Hank漂洗軟骨小塊3次，放入至10 cm×10 cm IMDM培養液瓶中。移入離心筒中，1 400 r/min離心5 min。收集全部切碎軟骨，加入0.25%胰酶(含0.04%EDTA)，37℃消化30 min。吸出胰酶，加入4 ml 0.2%Ⅱ型膠原酶，置CO2培養箱中37℃消化4 h，每0.5 h取出振搖3 min。收集上清液，1 400 r/min離心10 min，棄上清，懸浮細胞于16 ml IMDM培養液中，200目過濾至一新無菌離心管中。5×104接種于培養瓶中，置CO2培養箱中37℃培養。

1.3.2 軟骨細胞中ROS的測定 按照1∶1 000用無血清培養液稀釋DCFH-DA，終濃度為10 μmol/L。細胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，控制細胞濃度在(1～20)×106/ml，37℃，20 min。每隔3～5 min顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。無血清培養液洗3次，充分去除未進入細胞內的DCFHDA。PBS重懸，流式細胞儀488 nm光激發，檢測525 nm發射光強度，計數10000個細胞，以檢測細胞內平均熒光強度反映ROS水平。

1.3.3 細胞培養上清中NO、SOD和GSH-Px含量的測定 分離獲取軟骨細胞并分組，按5×104/ml，每孔0.5 ml接種于24孔板，每組6個復孔，培養60 h待細胞貼壁后，依據分組更換正常培養液或含不同濃度AHF的培養液，繼續培養48 h，收集細胞培養上清，5 000 r/min，離心10 min，取上清-20℃凍存待測。NO檢測：鑒于NO性質極不穩定，在體內、體外均能很快生成亞硝酸鹽和硝酸鹽，因此測定標本中亞硝酸鹽和硝酸鹽濃度可以作為衡量NO水平的指標。檢測采用經典Griess法，操作按照說明書進行。SOD和GSH-Px檢測按照說明書進行。

1.3.4 細胞相關炎性因子表達的檢測 細胞培養3 d后，提取各組細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA，以其為模板，PCR擴增各目的基因，產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定。引物序列如下：p53(444 bp)上游：5'-ACAGAAACACCTTCCGACAC-3'，下游：5'-CCTGGGCATCCTTTAGCT-3';IL-1β(474 bp)上游：5'-TGCTGTCCAGACGAGGGCAT-3'，下 游：5'-ACTCTCCAGCTGCAGGGTAG-3';iNOS(465 bp) 上游：5'-CATGAAGTACATGCAGAGCG-3'，下游：5'-GCAAGGCGCAGCTGAACAAG-3';GAPDH(618 bp)上游：5'-GAGCCAAAAGGGTCATCATC-3'，下 游：5'-TGTGGCCAAATTCGTTGTCA-3'。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 軟骨細胞中ROS水平的變化

與對照組比較，模型組ROS水平明顯升高(P＜0.01)，說明OA軟骨細胞中確實存在氧化損傷。與模型組比較，蝦青素低、中、高劑量組可使ROS水平顯著降低(P＜0.01);說明加入不同劑量的蝦青素后，降低了OA軟骨細胞中ROS的水平。見表1。

2.2 軟骨細胞培養上清中NO、SOD和GSH-Px水平變化

與對照組相比，模型組NaNO2含量明顯升高(P＜0.01)，而SOD活性、GSH-Px活性明顯降低(P＜0.01)。與模型組比較，蝦青素低、中、高劑量組可顯著降低NaNO2含量，顯著升高SOD活性、GSH-Px活性(均P＜0.01)。見表1。

2.3 軟骨細胞相關炎性因子表達的影響

與對照組相比，模型組IL-1β、iNOS和 p53基因 mRNA的表達顯著降低(P＜0.01)。與模型組比較，蝦青素低、中、高劑量組可顯著升高IL-1β、iNOS和p53基因mRNA的表達量(P＜0.01)。見表2。

表1 軟骨細胞中ROS、NO、SOD和GSH-Px水平的變化(n=6s)

表1 軟骨細胞中ROS、NO、SOD和GSH-Px水平的變化(n=6s)

與對照組比較：1)P＜0.01;與模型組比較：2)P＜0.01;下表同

組別 ROS NaNO2(μmol/L) SOD(U/ml) GSH-Px(U)對照組6.02±0.51 5.63±0.40 52.11±5.08 79.90±6.01模型組 12.31±1.371) 9.89±0.621) 30.08±3.311) 56.15±4.881)蝦青素低劑量組 10.21±1.222) 8.26±0.602) 39.12±3.222) 64.28±4.802)蝦青素中劑量組 9.26±1.102) 7.89±0.562) 46.03±3.622) 70.11±5.322)蝦青素高劑量組 8.17±0.732) 7.10±0.542) 48.74±3.702) 74.52±5.402)

表2 軟骨細胞相關炎性因子IL-1β、iNOS和p53基因mRNA表達變化(n=6±s)

表2 軟骨細胞相關炎性因子IL-1β、iNOS和p53基因mRNA表達變化(n=6±s)

組別 IL-1β/GAPDH iNOS/GAPDH p53/GAPDH對照組8.12±0.66 23.52±2.11 30.17±2.50模型組 12.37±1.131) 36.83±3.291) 49.69±2.801)蝦青素低劑量組 10.79±1.102) 30.26±3.002) 42.19±2.802)蝦青素中劑量組 10.10±0.922) 27.46±2.782) 40.06±2.522)蝦青素高劑量組 9.33±0.722) 25.89±2.592) 38.36±2.372)

3 討論

所謂ROS，是指機體內或者自然環境中由氧組成、含氧并且性質活潑的物質總稱，主要有一種激發態的氧分子，即重態氧分子或稱單線態氧分子。常見的兩種含氧的自由基分別為超氧陰離子自由基、羥自由基;三種過氧化物，分別為過氧化氫和過氧化脂質以及一種含氮的氧化物。ROS以其高反應性在生命活動中扮演了重要的角色，是近年來軟骨細胞信號轉導領域研究的熱點〔3〕。本研究說明OA軟骨細胞存在著氧化損傷。蝦青素對OA的治療作用可能是通過抗氧化損傷機制實現的。

IL-1β表達增高對軟骨損傷和退化具有重要作用，其能通過蛋白激酶MAPK激活核轉錄因子-κB(NF-κB)等信號通路，刺激MMP-1大量表達，引起軟骨更為強烈的吸收〔4〕。發生OA的關節軟骨細胞iNOS表達增高。iNOS催化精氨酸與氧分子的反應，形成一氧化氮，與抑制軟骨細胞蛋白聚糖合成和誘導軟骨細胞凋亡過程有關〔5〕。OA病變的軟骨組織出現凋亡細胞明顯增加，且與OA病情分級呈正相關〔6〕。p53是一種重要的細胞周期調節因子，在細胞凋亡過程中起關鍵作用。本實驗結果顯示，劑量為10～30 μg/ml的蝦青素能抑制軟骨細胞IL-1β、iNOS、p53的表達，大大降低炎性反應的發生，延緩細胞凋亡進程。綜上所述，本實驗初步證實蝦青素對OA軟骨細胞具有一定的生長調節作用，可有效降低軟骨細胞因氧化而造成的損傷，減緩細胞凋亡速度，提高細胞抗炎能力，從而達到治療OA的目的，但其作用機制尚需進一步探討。

1 惠伯棣，裴凌鵬.類胡蘿卜素化學及生物化學〔M〕.北京：中國輕工業出版社，2005：317-22.

2 劉獻祥，李 西，周江濤.改良Hulth造模法復制膝骨性關節炎的實驗研究〔J〕.中國中西醫結合雜志，2005;25(12)：1104-8.

3 Le Bras M，Clement MV，Pervaiz S，et al.Reactive oxygen species and the mitochondrial signaling path way of cell death〔J〕.Histopathol，2005;20(1)：205-19.

4 Aigner T，Soeder S，Haag J.IL-1beta and BMPs-interactive players of cartilage matrix degradation and regeneration〔J〕.Eur Cell Mater，2006;12：49-56.

5 Schmidt N，Pautz A，Art J，et al.Transcriptional and post-transcriptional regulation of iNOS expression in human chondrocytes〔J〕.Biochem Pharmacol，2010;79(5)：722-32.

6 Kim HT，Teng MS，Dang AC.Chondrocyte apoptosis：implications for osteochondral allograft transplantation〔J〕.Clin Orthop Relat Res，2008;466(8)：1819-25.

Study of Astaxanthin on anti-oxidative damage and anti-inflammatory of osteoarthritis cartilage cells

PEI Ling-Peng，BAI Yan，HUI Bo-Di.
MINZU University of China，State Nationalities Affairs Commission and Department of Educational Key Lab of Minority Traditional Medicine，Beijing 100081，China

Objective Objective：To study the reverse effect of the oxidative damage and inflammatory on cartilage cells by Astaxanthin.Methods Fifteen New Zealand white rabbits of 5 month old were selected.Osteoarthritis cartilage cells in model groups were added Astaxanthin 10，20，30 μg/ml respectively.A group of animals were sacrificed every week from the ninth weeks and the cartel age cells were isolated and cultured.For 8 w，the level of reactive oxygen species(ROS)in chondrocyte was detected by DCFH-DA，the content of NO and the activity of SOD and GSH-Px in cell culture supernatant were detected by Griess method.The related expression contents of IL-1β/GAPDH，iNOS/GAPDH and p53/GAPDH were detected by RT-PCR.Results DCFH-DA detection of intracellular reactive oxygen species in control group was less than that in model group and that in Astaxanthin groups was less than that in model group(P＜0.01).The contents of NaNO2，SOD and GSH-Px in osteoarthritis model group had significant differences with those of control group(P ＜0.01);and those in Astaxanthin groups had significant differences with those of control group(P＜0.01).The related expression contents of IL-1β/GAPDH，iNOS/GAPDH，p53/GAPDH in Astaxanthin groups were significant with model group.Conclusions Astaxanthin has anti-oxidative damage and anti-inflammatory effect of osteoarthritis cartilage cells within a certain dose range.It might be the main mechanism for astaxanthin to treat osteoarthritis.

Astaxanthin;Osteoarthritis;Chondrocytes;Oxidative damage;Inflammatory factor

R68

A

1005-9202(2012)23-5182-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.037

國家自然科學基金資助(No.30902011);教育部“中央高校基本科研業務費專項資金”資助(No.0910KYCZ01);教育部“長江學者和創新團隊發展計劃”資助(IRT0871)

1 北京聯合大學應用文理學院

裴凌鵬(1976-)，男，博士，副研究員，主要從事民族醫藥與膳食營養研究。

〔2011-10-24收稿 2012-01-15修回〕

(編輯 張永貴/胡國義)