肺康飲口服液對Ncl-H446細胞生長及凋亡的影響

羅 強 孫 黎 張淑萍 李 旺 張林西 (河北北方學院實驗中心，河北 張家口 075000)

肺康飲口服液對Ncl-H446細胞生長及凋亡的影響

羅 強 孫 黎 張淑萍1李 旺1張林西 (河北北方學院實驗中心，河北 張家口 075000)

目的 通過觀察肺康飲口服液對人小細胞肺癌Ncl-H446生長及凋亡的影響，探討其體外的抗腫瘤效應。方法 體外培養Ncl-H446細胞，以不同濃度的肺康飲口服液作用為實驗組，并設對照組，CCK8法測細胞增殖抑制效應、透射電鏡觀察藥物對細胞形態學的影響，流式細胞術檢測Ncl-H446細胞凋亡。結果 不同濃度肺康飲口服液作用Ncl-H446細胞24 h增殖抑制明顯(P＜0.05)，其抑制效應具有劑量依賴的特點;電鏡及流式顯示Ncl-H446細胞凋亡。結論 肺康飲口服液可抑制Ncl-H446細胞的生長且增殖抑制效應具有劑量依賴性，并可誘導腫瘤細胞凋亡。

肺康飲口服液;Ncl-H446;CCK-8

肺癌是目前公認的全球發病率最高的惡性腫瘤之一，而且其較高的死亡率和較低的治愈率一直以來都是臨床較難攻克的一道難題〔1〕。小細胞肺癌常見于老年人，是一種全身性疾病，治療以化療為主，但老年患者由于特殊的身體條件，不能耐受常規劑量的化療，目前對于老年人小細胞肺癌的治療，文獻報道仍存在分歧〔2，3〕。肺癌按組織病理分型主要分為小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC)，其中SCLC的癌細胞體積雖然很小，但是，卻是各類肺癌中惡性程度最高、預后極差的一種〔4〕。有很多研究發現腫瘤耐藥性的產生通常都伴有凋亡抑制現象〔5〕。肺康飲是由竹葉、桑葉等數位中藥組成的中藥復方，經臨床觀察對肺癌患者有一定的療效〔6〕，但作用機制還不清楚。為此本研究主要通過肺康飲口服液對人小細胞肺癌增殖與凋亡作用來探討其作用機制并為肺康飲口服液進一步研究開發與臨床治療提供新的依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

人小細胞肺癌細胞株Ncl-H446由協和醫科大學遺傳室惠贈。DMEM培養基(Gibco公司)，胎牛血清(天津市川頁生化制品有限公司)，CCK-8(上海同仁化學)，瓊脂糖、100 bp DNA marker(北京六和同公司)，細胞周期試劑盒(美國BD公司)。美國SpectraMax M2e多功能微孔板檢測系統，美國 FACSA ria流式細胞儀，日本電子100CS-Ⅱ型透視電鏡，LKB-Ⅲ型超薄切片機。

1.2 肺康飲口服液的制備

肺康飲口服液按水煎醇沉法制備而成，生藥含量為1 g/ml，pH7.0，以0.22 μm微孔濾器過濾除菌，分裝4℃保存。使用時以培養液稀釋至所需藥物濃度。

1.3 Ncl-H446細胞培養

培養基，37℃、5%CO2條件下培養。取對數生長期細胞用不同濃度肺康飲口服液處理。

1.4 CCK-8法檢測細胞增殖抑制

取對數生長期密度為5×104/ml的Ncl-H446細胞，接種于 96孔培養板，100 μl/孔。用DMEM培養液將肺康飲口服液稀釋成2.379，1.586，1.269，0.793，0.476 mg/ml 5個不同濃度，分別加入96孔培養板(100 μl/孔)，每組設4個復孔，對照組加入等體積培養液，置37℃、5%CO2培養24 h。然后每孔加入CCK-8 20 μl繼續培養4 h，之后用SpectraMax M2/M2e多功能微孔板檢測系統測吸光度(A490值)，按公式計算細胞抑制率;抑制率(%)=(1-實驗組平均A490值/對照組平均A490值)×100%。

1.5 電鏡觀察細胞形態及凋亡情況

細胞(密度為1×106/ml)分別接種于4個50 ml的培養瓶中，貼壁后換不同濃度的肺康飲口服液培養液(0.793，1.269，1.586 mg/ml)、并設對照，作用5 h后，收集細胞，常規固定、脫水、包埋、切片、染色，進行透射電鏡觀察。

1.6 流式細胞儀檢測凋亡細胞

取處于對數生長期的Ncl-

取對數生長期Ncl-H446

細胞用含10%胎牛血清的DMEM H446細胞，加入上述不同濃度肺康飲口服液培養24 h后，消化細胞，制成單細胞懸液，1 000 r/min離心7 min，PBS洗滌2次，配成1×106/ml細胞懸液，70%冰乙醇-20℃固定，上機測定前，離心去乙醇，用PBS洗滌2次，用0.5 ml PBS懸浮細胞制成細胞懸液，加入PI染液0.5 ml，4℃避光染色30 min，上流式細胞儀檢測凋亡情況。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 肺康飲口服液對Ncl-H446細胞增殖的影響

CCK-8法檢測 2.379，1.586，1.269，0.793，0.476 mg/ml 5 個不同濃度的肺康飲口服液作用Ncl-H446細胞24 h，對 Ncl-H446細胞的生長有不同程度的抑制作用，并隨著肺康飲口服液濃度的增加，對Ncl-H446細胞抑制率也增加，分別為11.28%、21.00%、52.62%、68.00%、78.45%。其增殖抑制效應具有明顯的量效關系(P＜0.05)。見表1。

2.2 細胞形態學觀察

對照組肺癌細胞表面有很多微絨毛，胞質內有較豐富的細胞器，如線粒體、粗面內質網、核糖體等清晰可見。核圓形，核膜清晰，核內染色質呈細沙粒狀，異染色至少。核仁大;給藥組細胞膜結構發生變化，核體積變小，染色體邊集合膜下，核膜清晰，細胞內膜結構呈凋亡早期的改變，部分壞死細胞膜斷裂，細胞內膜結構消失，胞質內被大量脂滴所充填，少量細胞核固縮形成高電子斑塊邊集合膜下，細胞表面伸出長的突起，細胞內膜結構為凋亡晚期的改變。見圖1。

表1 肺康飲口服液對Ncl-H446細胞增殖的影響

圖1 不同濃度的肺康飲作用小細胞肺癌后，電鏡下細胞形態學的改變(×5 800)

2.3 肺康飲口服液對Ncl-H446細胞周期的影響

1.586、1.269、0.793、0.476 mg/ml肺康飲口服液處理的 Ncl-H446細胞，均出現一個亞二倍體的凋亡峰，其峰值(即凋亡細胞的細胞數與總細胞數的比值)隨肺康飲口服液濃度增高逐漸增高，其峰值分別為 5.53%、7.12%、10.34%、21.14%及29.68%。對照組無亞二倍體凋亡峰。

經2.379、

3 討論

小細胞肺癌占全部肺癌的20%左右，遠期療效不佳。雖然化療是治療該病的主要手段之一，但有關老年人小細胞肺癌治療的研究報道不多，常被排除在治療和研究之外〔7，8〕。小細胞肺癌為中老年疾病，尤以老年人多見，隨著世界人口老齡化趨勢的加重，老年小細胞肺癌的發病率也呈上升趨勢〔9〕。從細胞動力學觀點看，該型肺癌生長迅速，倍增時間短〔10〕。

腫瘤的發生有其遺傳物質基礎，主要表現為多基因突變所致的細胞失控性生長，細胞增殖失控和細胞凋亡受阻是其發生、發展的主要原因〔11〕。細胞凋亡或稱程序性細胞死亡(PCD)，即有核細胞在一定條件下啟動自身的內部機制使得內源性DNA內切酶激活而引起的細胞死亡過程，即受基因、信使調控的單個細胞自殺過程〔12〕。細胞凋亡有別于壞死細胞主動性自殺，是受多基因控制的有序性死亡過程。誘導腫瘤細胞凋亡和進一步闡明凋亡的基因調控機制，是目前腫瘤治療新的研究熱點〔13〕。凋亡最突出的生化特征是內源性Ca2+/Mg2+依賴性核酸內切酶的活化在和小體連接區切割DNA雙鏈，使DNA降解成200 bp或其整數倍的寡核苷酸片段。細胞出現凋亡時，出現明顯的核固縮、凝聚、斷裂，膜出泡，形成凋亡小體;經流式細胞儀DNA定量分析圖出現顯著的細胞凋亡峰。目前所發現的能夠誘導細胞凋亡的西藥很多，但由于毒副作用較大而應用受到一定限制，因此中藥誘導肺癌細胞凋亡受到越來越多的關注〔14〕。

肺康飲口服液作為常見的損傷性誘導因子誘導腫瘤細胞凋亡其主要作用是引起CD4+細胞、CD8+細胞的缺失，阻斷部分蛋白酶的活化或者抑制它們的功能〔15，16〕。為闡明肺康飲口服液的抗腫瘤作用機制，本研究采用透射電鏡鏡形態學觀察、流式細胞術檢測Ncl-H446細胞凋亡特征，從而證實肺康飲口服液抗腫瘤細胞(Ncl-H446)機制是誘導其凋亡。實驗中CCK-8法檢測結果顯示肺康飲口服液作用Ncl-H446細胞的增殖抑制作用存在明顯的量效關系，且隨著濃度增加抑制率明顯增強。

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Effects of Feikangyin oral liquid on growth and apoptosis of Ncl-H446 cells

LUO Qiang，SUN Li，ZHANG Shu-Ping，et al.
Central Laboratory，Hebei North University，Zhangjiakou 075000，Hebei，China

Objective To observe the Feikangyin oral liquid on growth and apoptosis of Ncl-H446 and explore the anti-tumor effect in vitro.Methods Ncl-H446 cells were cultured in vitro with different concentrations of Feikangyin in experimental and the control groups.Cell proliferation was measured by CCK8 method.Cell morphology was observed by transmission electron microscopy.Flow cytometry was used to detect the protein expression in Ncl-H446 cells.Results Effects of different concentration of Feikangyin at 24 h on Ncl-H446 cell growth inhibition were significant(P＜0.05)，and the inhibitory effect had a dose-dependent characteristics.Flow cytometry and transmission electron microscopy showed that Feikangyin could induce Ncl-H446 cells apoptosis.Conclusions Feikangyin could inhibit the growth of Ncl-H446 cells，the inhibition has a dose-dependent，could induce tumor cell apoptosis.

Feikangyin;Ncl-H446;CCK-8

R393

A

1005-9202(2012)23-5206-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.047

河北省科技廳項目(No.062761618)

1 河北北方學院中醫教研室

羅 強(1977-)，男，實驗師，主要從事細胞生物學研究。

〔2011-05-26收稿 2012-01-10修回〕

(編輯 曹夢園)