攜帶人TRAIL基因的雙靶向溶瘤腺病毒與X線聯合抑瘤效應

樸春姬 孫曉玲 劉麗波 李林芳 劉 輝 張海英

(吉林大學公共衛生學院放射損傷教研室，吉林 長春 130021)

攜帶人TRAIL基因的雙靶向溶瘤腺病毒與X線聯合抑瘤效應

樸春姬 孫曉玲 劉麗波 李林芳1劉 輝1張海英

(吉林大學公共衛生學院放射損傷教研室，吉林 長春 130021)

目的 探討攜帶人TRAIL基因的溶瘤腺病毒CNHK500-hTRAIL，聯合X線照射對A549細胞生長的影響。方法 將質粒pPE3-hTRAIL與pSG500用Lipofectamine2000共轉染至293細胞內同源重組，包裝出的溶瘤腺病毒CNHK500-hTRAIL，采用PCR法進行鑒定，并在293細胞中大量擴增病毒，采用50%組織培養感染計量法測定病毒滴度，以MOI為5的溶瘤腺病毒CNHK500-hTRAIL感染A549細胞24 h，用RT-PCR法檢測hTRAIL基因在腫瘤細胞中的表達。用不同MOI值(0.01～40)的CNHK500-hTRAIL感染A549細胞，感染5 d，通過四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法檢測其對A549細胞的細胞存活率，以便確定適宜的感染滴度。用CNHK500-hTRAIL感染A549細胞，感染后48 h，用不同劑量的X線(1和2 Gy)照射，照射后3 d，通過MTT比色法檢測CNHK500-hTRAIL聯合X線照射下A549細胞的細胞存活率。結果 PCR法鑒定表明溶瘤腺病毒CNHK500內攜帶hTRAIL基因，制備的CNHK500-hTRAIL病毒滴度為3.25×109PFU/ml，且CNHK500-hTRAIL攜帶的hTRAIL基因在A549細胞中有效表達。經不同MOI值CNHK500-hTRAIL感染A549細胞，細胞存活率為64.26%～96.02%。CNHK500-hTRAIL感染聯合不同劑量X線照射組細胞存活率較單純X線照射(1和2 Gy)和單純CNHK500-hTRAIL感染組明顯降低(P＜0.01)，細胞存活率分別為50.77%和45.56%，增敏效應比值(E/O)為1.5和1.6，均大于1.4。結論 成功構建了攜帶hTRAIL基因的溶瘤腺病毒CNHK500-hTRAIL，CNHK500-hTRAIL感染與X射線聯合照射對A549細胞生長有協同抑制作用。

肺癌;溶瘤腺病毒;腫瘤壞死因子相關誘導凋亡配體;放射治療;細胞存活率

腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)作為TNF家族1995年被Wiley等〔1〕發現以來，諸多研究證實，具有選擇性誘導腫瘤凋亡作用，從而對正常細胞無凋亡誘導作用。目前，已有TRAIL與電離輻射有協同抗腫瘤作用的報道〔2〕，但尚無溶瘤腺病毒介導的TRAIL基因與電離輻射聯合抑瘤作用的報道。本文旨在探討攜帶TRAIL基因的溶瘤腺病毒CNHK500-hTRAIL聯合X線照射對人肺腺癌細胞A549生長的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

質粒pPE3-hTRAIL和pSG500以及空病毒載體(CNHK500)由上海東方肝膽外科醫院病毒與基因治療中心協助構建，293細胞購自加拿大Microbix Biosystems公司，A549細胞由本室保存。病毒DNA提取試劑盒購自QIAGEN公司，DMEM及 RPMI1640培養液購自 GIBCO-BRL公司，Revert AidTM First Strand Cdna Synthesis Kit購自Fermentas公司，2×Taq MasterMix購自CWBIO公司，四甲基耦氮唑藍(MTT)及二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司。

1.2 病毒的構建與鑒定

取已制備的兩株重組病毒毒株(將質粒pPE3-hTRAIL與pSG500用Lipofectamine2000共轉染至293細胞，出現病毒空斑，經過3次病毒空斑純化，得到)用QIAGEN DNA Blood Mini Kit試劑盒提取病毒DNA。以病毒DNA為模板用擴增hTRAIL基因及mcmv啟動子基因的兩對引物做PCR鑒定，經鑒定正確的病毒命名為CNHK500-hTRAIL。鑒定CNHK500-hTRAIL病毒的引物序列見表1。

表1 鑒定CNHK500-hTRAIL病毒的引物序列

1.3 病毒的制備

20 ml 10%FBS/DEME培養75 cm2培養瓶中長至80% ～90%293細胞，然后換成2%FBS/DEME 15 ml，去0.5 μl首次擴增的病毒保存液(病毒空斑感染24孔獲得)，小心加入病毒混合液，十字形慢慢晃動3次，37℃、5%CO2孵箱中培養48 h后分別收集病毒上清和細胞沉淀，-80℃至37℃反復凍融3次，600 r/min離心20 min去沉淀取上清，反復擴增至需要病毒量。用氯化銫密度梯度離心法純化病毒，并用50%組織培養感染計量法(TCID50)測定病毒滴度〔3〕。

1.4 病毒的表達

將3×106個A549細胞接種于35 cm2培養瓶中，用10%FBS/RPMI1640培養24 h后棄去培養液加入按MOI值為5稀釋于1.2 ml無雙抗無血清RPMI1640培養液中的CNHK500-hTRAIL病毒，十字形輕輕晃動3次，37℃5%CO2孵箱中培養，每隔20 min十字形晃動兩次培養2h后加入2%FBS/RPMI1640培養液8 ml繼續培養。培養24 h后收集細胞，用Trizol法提取總RNA后用RT-PCT試劑盒合成第一鏈總cDNA，再以總cDNA為模板用hTRAIL引物，以GAPDH為內參照進行PCR擴增。hTRAIL引物序列：上游引物：5'-CCCATCGATGGGATGACCTCTGAGGAAACC-3'，下游引物：5'-CTAGTCTAGA CTAGTTAGCCAACTAAAAA-3'。

1.5 不同MOI值CNHK500-hTRAIL對A549細胞生長的影響

取對數成長期的肺腺癌細胞A549接種于96孔板，每孔細胞數為5×103，細胞液量為 150 μl，接種細胞在 5%CO2孵箱內培養24 h，棄去培養液，用不同MOI值CNHK500-hTRAIL感染。用無雙抗RPMI1640培養液稀釋由低至高共12個MOI值病毒液，即 0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、40，每組設6復孔，加入病毒液50 μl/孔后在CO2孵箱內培養90 min，每隔15 min中十字輕搖一次，最后再加150 μl 10%FBS/RPMI1640，繼續培養5 d用MTT比色法檢測OD值〔4〕。

細胞存活率=(實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.6 CNHK500-hTRAIL聯合X射線照射對A549細胞生長的影響

實驗分為 7組，即 A549/0 Gy、A549/CNHK500/0 Gy、A549/1 Gy、A549/2 Gy、A549/CNHK500-hTRAIL/0 Gy、A549/CNHK500-hTRAIL/1 Gy和 A549/CNHK500-hTRAIL/2 Gy。取對數成長期的 A549細胞接種于96孔板，5×103/孔。置于37℃、50 ml/L CO2孵箱內培育24 h后以 MOI值為5感染CNHK500-hTRAIL及空病毒CNHK500(病毒感染方法同上)病。病毒感染后繼續培養48 h，進行不同劑量(1和2 Gy)X射線照射。照射條件：深部X射線治療機，電壓為180 V，電流為18 mA，劑量率為0.38 Gy/min。照射后3 d用MTT法檢測細胞存活分數，并分析CNHK500-hTRAIL和X射線是否具有協同作用。MTT法同上。參照夏云飛等〔5，6〕提出的計算E/O值(預期值/觀察值)的方法來判斷兩種干預因素之間有無協同作用。當E/O＞1.4時，認為有協同作用。E=(T2/T1)×(T3/T1);O=(T4/T1)，其 中 T2/T1、T3/T1、T4/T1 分 別 為 A549/CNHK500、A549/1 Gy(或 2 Gy)、A549/CNHK500-hTRAIL/1 Gy(或2 Gy)的細胞存活分數。

1.7 統計學處理

采用SPSS13.0軟件進行t檢驗。

2 結果

2.1 重組病毒鑒定

擴增出hTRAIL基因(521 bp)及mcmv啟動子基因(846 bp)。經鑒定與陽性對照(pPE3-hTrail質粒)一致，兩個克隆均為CNHK500-hTRAIL，證實CNHK500-hTRAIL病毒構建成功。見圖1。

M：Gene Ruler DNA Ladder Mix;N：陰性對照;P：pPE3-hTRAIL 質粒;1、2為病毒 CNHK500-hTRAIL的2個病毒克隆;M左為 AT310+AT311擴增hTRAIL基因(521 bp)，M右為GT210+GT211擴增mcmv啟動子(846 bp)

2.2 重組病毒的純化、擴增及滴度測定

選擇克隆1病毒CNHK500-hTRAIL在293細胞中反復擴增后收集病毒液用氯化銫梯度離心法進行純化得到的病毒液用50%組織培養感染計量法測定病毒滴度。CNHK500-hTRAIL病毒滴度為3.25×109PFU/ml。

2.3 目的基因表達

感染CNHK500-hTRAIL病毒的A549細胞中擴增出目的基因hTRAIL片段(596 bp)和GAPDH基因片段(490 bp)，對照組A549細胞中只擴增出GAPDH基因片段。見圖2。

2.4 不同MOI值CNHK500-hTRAIL對A549細胞生長的影響

隨MOI值由低到高，細胞存活率總體下降的趨勢為(96.02±2.61)%、(94.52±3.92)%、(90.46±2.25)%、(91.98±2.27)%、(88.02±3.07)%、(86.59±3.28)%、(87.72±4.09)%、(85.77±2.57)%、(79.15±4.48)%、(76.40±3.50)%、(67.18±4.83)%、(64.26±2.19)%。最高值和最低值相差約1.5倍，提示CNHK500-hTRAIL對肺腺癌細胞A549生長具有明顯的抑瘤作用。選擇CNHK500-hTRAIL的MOI值5作為研究與X射線聯合抑瘤效應的病毒感染滴度。

2.5 CNHK500-hTRAIL聯合X射線照射對A549細胞生長的影響

不同劑量(1和2 Gy)X射線照射對肺腺癌細胞A549的生長有明顯的抑制作用(P＜0.01)。單純CNHK500-hTRAIL組對肺腺癌細胞A549的生長也有明顯的抑制作用(P＜0.05)。CNHK500-hTRAIL聯合X線照射(1 Gy和2 Gy)肺腺癌細胞A549，使其存活分數明顯低于對應相同劑量單純照射組(均為P＜0.01)，其中2 Gy聯合照射組抑制作用更明顯(P＜0.05)。提示，CNHK500-hTRAIL聯合X線照射對肺腺癌細胞A549細胞有顯著抑瘤作用，優于單純CNHK500-hTRAIL感染組及單純照射組。計算E/O值(預期值/觀察值)的方法來判斷CNHK500-hTRAIL和X線照射之間有無協同作用，CNHK500-hTRAIL聯合1 Gy照射時E/O值為1.5，CNHK500-hTRAIL聯合2Gy照射時 E/O為1.6，兩者均大于 1.4，提示CNHK500-hTRAIL與X射線照射對腫瘤細胞的生長具有協同抑制作用。見表2。

圖2hTRAIL基因RT-PCR產物凝膠電泳圖

表2CNHK500-hTRAIL聯合X射線照射對A549細胞生長的影響(± s，n=6)

表2CNHK500-hTRAIL聯合X射線照射對A549細胞生長的影響(± s，n=6)

與CNHK500/0 Gy比較：1)P＜0.05;與 A549/1 Gy組比較：2)P＜0.01;與A549/2 Gy比較：3)P ＜0.01;與 CNHK500-hTRAIL/0 Gy組比較：4)P ＜0.01

組別 細胞存活率(%)A549/0 Gy 100 A549/CNHK500/0 Gy 95.17±4.78 A549/CNHK500-hTRAIL/0 Gy 84.51±3.171)A549/1 Gy 4±1.82 A549/2 Gy 83.51±3.98 A549/CNHK500-hTRAIL/1 Gy 50.77±4.262)4)A549/CNHK500-hTRAIL/2 Gy 45.56±3.653)4)

3 討論

惡性腫瘤的腫瘤基因放射治療，因其可通過基因的介導來增強放射治療療效，所以也越來越得到研究者們的關注。目前為提高惡性腫瘤基因-放射治療的治療效果，研究的關鍵是：①進一步選擇有效的治療基因;②借助轉染效率較高的載體系統最大限度地將基因導入受體細胞和靶細胞;③提高腫瘤基因治療的靶向性。人的 TRAIL基因位于染色體3p26 h，編碼32.5 kD的Ⅱ型跨膜蛋白，由281個氨基酸組成，是TNF超家族成員之一，TRAIL與腫瘤細胞的死亡受體TRAIL-R1/DR4和TRAIL-R2/DR5結合后，啟動細胞內的凋亡信號傳導，激發Caspase蛋白酶解級聯反應，導致腫瘤細胞死亡〔7〕。肝、肺等多種腫瘤細胞株都對TRAIL敏感，TRAIL在腫瘤基因治療領域受到了越來越多的重視〔8〕。

一種新型的雙靶向溶瘤腺病毒CNHK500是利用人實體瘤內存在端粒酶陽性和缺氧微環境兩個重要特性，分別用人端粒酶逆轉錄酶啟動子(hTERT promoter)調控腺病毒復制必需基因E1A基因，用缺氧反應啟動子(HRE promoter)調控腺病毒復制必須基因E1B基因，因此CNHK500只有在端粒酶陽性和缺氧微環境的人實體瘤內選擇增殖。CNHK500的E3區可插入目的基因表達盒。CNHK500對腫瘤細胞的選擇性增殖能力明顯優于單純人端粒酶逆轉錄酶啟動子調控的腺病毒CNHK300及國際上公認的腫瘤增殖病毒ONYX-015，提高了療效/毒性比。目前，CNHK500是國際上最為廣譜和特異性的溶瘤病毒及基因-病毒治療系統〔9〕。

本文結果CNHK500-hTRAIL感染與X射線聯合照射對A549細胞生長具有協同抑制作用，其可能與CNHK500-hTRAIL提高腫瘤細胞對放射治療的敏感性有關。理論上雙靶向腺病CNHK500-hTRAIL只能在端粒酶陽性的實體瘤的微缺氧環境下增殖，但本研究及劉永靖等〔10〕研究均證實，其也在體外培養的其他端粒酶陽性的腫瘤細胞中有效表達，并具有顯著地生長抑制作用或促凋亡作用。劉永靖等〔10〕研究報道，通過體外實驗證實CNHK500-hTRAIL選擇性地在端粒酶陽性的肝癌細胞株HepG2、Hep3B中的增殖能力顯著，比在正常肝細胞WRL-68中的增殖能力高出300倍之多，TRAIL表達量是正常細胞的約9倍，并可顯著誘導肝癌細胞凋亡。

CNHK500-hTRAIL感染與X射線聯合照射對肺腺癌細胞A549生長的協同抑制作用還有待于體內實驗的進一步證實。本研究為實驗基因-放射治療提供了重要理論依據。

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R737.14

A

1005-9202(2012)23-5221-04;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.055

吉林省科技發展計劃項目(No.200905186)

1 上海東方肝膽外科醫院病毒與基因治療中心

張海英(1970-)，女，副教授，博士，主要從事放射生物學及輻射防護研究。

樸春姬(1969-)，女，副教授，博士，主要從事實驗腫瘤基因放射治療研究。

〔2012-03-12收稿 2012-06-07修回〕

(編輯 趙慧玲/張 慧)