中國黃酒中香草醛的定性定量分析*

莫新良，徐巖，范文來

1(浙江工業職業技術學院黃酒學院，浙江紹興，312000)2(江南大學釀酒科學與酶技術中心，釀造微生物與應用酶學實驗室，江蘇無錫，214122)

香草醛，又名香蘭素，是香子蘭花莢中的典型香氣物質。因其具有令人愉悅的香莢蘭豆香氣，廣泛應用于食品、飲料等領域中，常作為香料添加于糕點、清涼飲料及酒類等食品中起助香作用［1］。香草醛是橡木桶貯存的葡萄酒中的重要香氣貢獻物質，主要來源于植物中木質素的降解［2］。

目前香草醛的檢測方法主要有液相色譜法［3－4］、氣相色譜法［2］、分光光度法［5］、電化學法［6］等，這些方法的靈敏度較低且線性范圍窄，對于樣品中含量較低的香草醛無法檢出。近年來有采用氣－質聯用(GC-MS)方法測定香草醛的報道［7］，由于應用了質譜檢測器，其定性方便、靈敏度較高，但因樣品前處理操作較繁瑣，未被廣泛應用。因此有必要開發一種簡便、快速、且靈敏度高的檢測方法來分析樣品中的微量香草醛。

黃酒是我國的一種傳統發酵酒，由于其營養豐富且風味獨特而深受人們喜愛，香氣是構成黃酒風味的重要因素，決定著黃酒風味的典型性。國內對于黃酒中的揮發性香氣成分已經進行了較全面深入的研究［8－9］。在已有研究中，研究者通過氣相色譜聞香法(GC-O)，發現香草醛是黃酒中的重要香氣物質［8］，但有關黃酒中香草醛的含量在文獻中未見報道，因此無法根據濃度從香氣活力值(OAV)的角度來證實其在黃酒中的重要性。本工作擬采用液－液微萃取結合氣－質聯用技術分析黃酒中香草醛的含量，用OAV法分析香草醛對黃酒的風味貢獻，并對黃酒貯存過程中香草醛的變化規律進行分析，為黃酒中香草醛的形成和作用機理研究及高品質黃酒的開發和生產提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和儀器

分析樣品為:浙江地區，市售黃酒分別命名為ZS-1、ZS-2、ZS-3、ZS-4，以及貯存 4年、5年、6年、9年、11年、12年、13年、14年的原酒;上海地區，市售黃酒分別命名為SS-1、SS-2，大罐新酒命名為SN-1、SN-2;江蘇地區，市售黃酒分別命名為JS-1、JS-2，大罐新酒命名為JN-1、JN-2;北方地區市售黃酒分別命名為 BS-1，BS-2。

香草醛(99%，分析純)和4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮(98%，分析純)購自Sigma-Aldrich(中國)公司;氯化鈉分析純、乙醚(分析純)，購自中國醫藥(集團)上海化學試劑公司;無水乙醇(色譜純)，美國TEDIA試劑公司。

水浴恒溫搖床振蕩器(SHA－2型，瑞華儀器)，高速冷凍離心機 J-E，美國 Beckman公司;安捷倫氣－質聯用儀，Agilent 6890 GC-5973 mass selective detector(MSD);MPS2自動進樣器，德國Gerstel公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

準確稱取一定量上述香草醛標準品配制到無水乙醇中，再取一定量加入到模擬黃酒中配制成系列濃度梯度的標準溶液，內標溶液為4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮，用無水乙醇溶解，終濃度均為98.61 μg/L。模擬黃酒采用超純水(Milli-Q系統，Millipore，Badford，MA，USA)配制，其中含有2.5 g/L乳酸，10%(V/V)乙醇，配制好的模擬酒將pH值調整到4.0。

1.2.2 樣品的濃縮預處理

取15 mL黃酒樣品于50 mL的離心管中，加4.5 g NaCl，加入內標4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮，終濃度為98.61μg/L，用1 mL重蒸過的乙醚萃取，將其蓋好后放置于振蕩器上振搖，溫度20℃，轉速250 r/min，30 min;振蕩搖勻萃取完成后，于4℃、8 000 r/min的條件下離心15 min，用0.2 mL的移液槍將上清有機相轉移到1mL的小瓶中，取0.1 μL進行GC-MS分析。

1.2.3 GC-MS分析

GC條件:進樣口和檢測器溫度均為溫度250℃，載氣He，流速2 mL/min;進樣量1 μL，不分流進樣;色譜分離柱為DB-FFAP(60 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm，J＆W Scientific);升溫程序:100 ℃ 恒溫 2 min，以10℃/min的速度升溫至 230℃，保持 10 min。

MS條件:電子轟擊(EI)電離源，電子能量70 eV;離子源溫度230℃;質量掃描范圍30～550 amu。

1.2.4 物質的定性與定量

定性方法:采用全掃描的方式(SCAN)獲得TIC總離子流圖對物質進行分析，未知物通過檢出其譜圖和NIST05a.L Database(Agilent Technologies Inc.)中標準譜圖的比對，以及與該物質標準品的保留時間進行比較來確定。

定量方法:應用內標標準曲線法對香草醛進行定量分析［10－11］。以 4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮為內標化合物，采用選擇特征離子法(SIM)對化合物峰面積進行積分，經過GC－MS檢測后利用待測物質和內標的相對峰面積比代入相對應的標準曲線方程計算出待測物質在黃酒中的含量。

1.2.5 香氣活力值(OAV)

香氣活力值是香氣化合物的濃度與該香氣化合物的(以10%乙醇溶液計)香氣閾值濃度之比，用以表征某種香氣化合物對香氣貢獻的大小。

2 結果與分析

2.1 萃取溶劑的選擇

香草醛是一種極性較強的物質，根據“相似相容”原理，需用極性較強的溶劑來萃取，故本研究討論了不同萃取溶劑:乙醚、二氯甲烷、乙醚∶二氯甲烷(體積比1∶1)對香草醛萃取效果的影響。發現3種萃取劑的效果相似，香草醛的加標回收率相近，均能滿足微量成分的分析要求。而用二氯甲烷、乙醚∶二氯甲烷(體積比1∶1)對香草醛萃取時，一些色素被萃取出來，故選用乙醚作萃取劑。

2.2 特征離子和定量離子的選擇及香草醛的定性分析

為消除其它雜質峰的干擾，采用選擇特征離子的方法(SIM)對標準品和黃酒樣品中的相應化合物進行掃描。圖1是香草醛和內標4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮的質譜圖。由圖1A可知，香草醛的碎片離子豐度最大峰 m/z為81，其次為109和123，m/z為152的是其分子離子峰。由圖1B可知，內標4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮的碎片離子豐度最大峰 m/z為121，其次為43，m/z為178的是其分子離子峰。依據選擇離子的原則，本方法所選用的香草醛的特征離子 m/z為81、109 、123和152，其中定量離子為152，內標4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮的特征離子m/z為121、178和43，定量離子為121。圖2是標準溶液香草醛及內標4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮的總離子流色譜圖，其出峰時間分別在21.501 min和26.543 min左右。圖3是黃酒樣品經萃取、離心后香草醛的選擇離子流(SIM)色譜圖。

圖1 標準溶液香草醛及內標4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮的質譜圖

圖2 標準溶液香草醛及內標4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮的總離子流色譜圖

圖3 黃酒樣品中香草醛的選擇離子色譜圖

2.3 黃酒中香草醛的定量依據

2.3.1 工作曲線、相關系數、線性范圍、檢出限與定量限

配制一系列濃度的香草醛標準溶液，對每個濃度水平進行6次重復測定，根據內標標準曲線法，做線性回歸分析，結果見表1。方法的線性關系良好，相關性系數為0.999 7。以信噪比(S/N)為3時所對應的標準物濃度值為檢出限，以信噪比為10時的濃度值為定量限(表1)。方法的檢出限和定量限分別為7.68 μg/L和 23.05 μg/L，滿足黃酒中香草醛的檢測要求。

2.3.2 回收率和精密度

將不同濃度的香草醛標準樣品加到模擬酒和實際樣品溶液中，對每個濃度重復測定6次，得到相應的回收率和相對標準偏差(表2)。回收率范圍在94.7% ～101.5%，相對標準偏差(RSD)均在10% 以內。能夠滿足微量成分的準確分析要求。

表1 線性回歸方程、相關系數、線性范圍、檢出限與定量限

表2 不同樣品的分析結果及在不同添加水平下香草醛的平均加標回收率和精密度(n=6)

2.4 黃酒中香草醛的定量分析

表3列出了不同地區不同品種黃酒中香草醛的含量情況。由表可以看出，不同黃酒之間香草醛的含量差異較明顯。仔細分析發現，雖然各種黃酒之間存在差異，但是差異之間也有規律可循，即一般市售普通成品酒如ZS-1、ZS-2等中的香草醛的含量(含量在159.97 ～1 112.41 μg/L)均高于新酒如 SN-1、SN-2、等中香草醛的含量(含量在80.12～100.29 μg/L);浙江地區市售普通成品酒如ZS-1、ZS-2、ZS-3、ZS-4等中的香草醛的含量高于江蘇、上海(高檔酒如SS-3、SS-4、SS-5除外)及北方地區市售黃酒中的含量;更有趣的發現是市售高檔成品酒如SS-3、SS-4、SS-5等中的香草醛的含量(含量均大于3 000 μg/L)均高于低檔酒如市售普通成品酒SS-1、SS-2等中的香草醛的含量。由此不難推斷香草醛這種香氣物質在區分不同黃酒的風味差異中起到了非常重要的作用，并且可以推斷貯存過程對香草醛在黃酒中含量的影響較大。

2.5 黃酒中香草醛的OAV分析

某種香氣物質的絕對含量并不能反映它對黃酒整體香氣的貢獻，還需要結合它的香氣閾值來分析。OAV是指香氣化合物的濃度和該化合物香氣閾值之比。通常來說，OAV ＞1.0的化合物會對整體香氣有貢獻，并且香氣活性值大的化合物其香氣貢獻亦大［12］。查閱文獻，香草醛在10% 的酒精溶液中香氣閾值為 60 μg/L［13］，根據香草醛的香氣閾值和濃度之比計算出其在各黃酒中的OAV，結果見表3。由表3可知，在所檢測的黃酒中，香草醛的OAV均大于1，因此其對該黃酒的整體香氣都有貢獻。其中，普通市售成品酒中的香草醛的OAV一般均大于5(SS-1列外)，高檔市售成品酒(SS-3、SS-4、SS-5)中香草醛的OAV均大于50。因此，從 OAV結果分析，香草醛是黃酒中重要的香氣貢獻物質。據文獻報道在普通紅葡萄酒中，香草醛的OAV在0.7 ～ 2.1［13］，而本研究結果得到的黃酒中的香草醛的OAV在1.3～67.6，證明香草醛確實是黃酒中有重要貢獻的香氣化合物，這也是黃酒具有獨特的風味而區別于其它飲料酒的重要因素之一。

表3 不同黃酒中香草醛的含量(μg/L)及香氣活力值(OAV)

2.6 黃酒貯存過程中香草醛的變化

根據2.4中的分析，貯存過程對香草醛在黃酒中含量的影響較大。因此，考察了浙江地區貯存4年、5年、6年、9年、11年、12年、13年、14年的黃酒原酒中香草醛含量的變化情況，結果見圖4。由圖4可知，黃酒中香草醛的含量隨著貯存時間延長而增加。這種結果和文獻報道的啤酒和葡萄酒的儲存過程中隨著貯存時間延長香草醛的增加情況相類似［14－15］。在葡萄酒貯存中，香草醛主要來源于橡木桶中木質素的熱降解［2］，在啤酒貯存中香草醛直接源于4-乙烯基癒瘡木酚的轉化，前驅物質是糧谷類植物細胞壁的阿魏酸［14］，而在黃酒貯存中香草醛的來源和形成機理則有待進一步的考察。

3 結論

圖4 不同貯存時間的黃酒中香草醛含量的變化

采用液－液微萃取結合氣相色譜－質譜聯用技術能夠快速、有效地分析黃酒中香草醛的含量，結果表明香草醛是區分不同黃酒風味差異的重要香氣物質。在所研究的黃酒中香草醛濃度高于其閾值，從OAV角度判斷香草醛對黃酒的風味有重要貢獻，并發現黃酒在貯存過程中香草醛含量增加，但其在貯存過程中的形成機理及影響因素有待進一步研究。

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