口腔真菌感染31例兩種檢測方法對比

西安交通大學口腔醫院檢驗科（西安710004）

牛 潔 黃 萍△ 苗群愛▲ 陳 鑫

隨著現代醫學技術的發展，介入性檢查治療手段的廣泛應用，腫瘤放化療、器官移植術后、社會老齡化及慢性疾病患者增加等因素，引起免疫功能低下人群的比例增高，特別是近年來大量新的、高效廣譜抗生素的臨床應用，使真菌感染日益增加，不但在醫院感染中越來越重要，成為重要的病原菌，而且使內臟、皮膚、黏膜被真菌感染者日益增多，真菌的臨床檢出率明顯增加，已占各類標本總檢出感染源的10%以上［1］。

在我院以口腔黏膜病前來就診的患者也有增加的趨勢，已引起臨床的廣泛關注。真菌學檢查是診斷真菌病的重要依據，隨著真菌感染病例的日益增多，對實驗室的診斷也提出了更高的要求。我院于2010年10月至2011年8月對31例疑似口腔真菌感染患者，進行黏膜標本檢測法和唾液標本檢測法對比分析，旨在找出檢測口腔真菌感染的最佳方法，為臨床減少漏診、誤診率以及真菌感染的確診提供更為準確的實驗室參考依據。

資料與方法

1 臨床資料 選擇在西安交通大學口腔醫院黏膜科就診患者31例，其中男16例，女15例，年齡17～86歲，平均61歲。男性假膜型1例、紅斑型13例、肥厚型2例；女性假膜型1例、紅斑型13例、肥厚型1例。患者入選標準以臨床診斷為主要依據進行篩選。對照組11例，其中男6例，女5例，年齡21～83歲，平均58歲。排除服用皮質激素或其他免疫抑制藥物、服用抗真菌藥物、糖尿病病人和HIV陽性者。

2 檢測試劑 沙保羅瓊脂由溫州康泰生物公司生產；假絲酵母菌顯色平板由鄭州安圖生物公司生產；10%KOH溶液由天津天力公司提供；快速革蘭染色液由溫州康泰生物公司提供；ATCC90028白假絲酵母菌由第四軍醫大學口腔醫院檢驗科黃萍博士惠贈。

3 實驗方法 實驗操作均嚴格按照《全國臨床檢驗操作規程》和試劑說明書進行。采集標本用一次性針管無菌采集患者唾液約0.5 ml，同時用一次性無菌拭子取病發或病損部位黏膜，范圍為1.0c m2左右面積內，擦拭5次。

3.1 黏膜標本檢測法：用于檢測采集的病發或病損部位黏膜。將采集的標本置于載玻片上，加1滴10%KOH溶液，然后蓋上蓋玻片并微微加熱，在顯微鏡下鏡檢有無孢子或菌絲。以檢見孢子或菌絲為陽性；將采集的病發或病損部位黏膜標本接種在沙保羅培養基上，37℃培養24～48h，將生長的菌落鏡檢確定為真菌后接種于假絲酵母菌顯色平板上，經37℃培養24～48h進行菌種鑒定。若菌種超出假絲酵母菌顯色平板外則歸為其它真菌。ATCC90028白假絲酵母菌作為陽性對照。

3.2 唾液標本檢測法：采集唾液標本進行革蘭染色后鏡檢，顯微鏡下若見到革蘭陽性圓形或卵圓形菌體或檢見菌絲即為陽性。同時將唾液標本0.1 ml進行培養與鑒定（培養與鑒定方法同黏膜標本檢測法）。

4 統計學處理 本組采用SPSS11.0統計軟件進行統計分析，計量資料組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有極顯著性差異。

結 果

1 兩組涂片檢測陽性率比較 見表1。用黏膜標本檢測的31例標本中，3例鏡檢為陽性，陽性率為9.67%；用唾液標本檢測的31例標本中，5例鏡檢為陽性，陽性率為16.12%，健康對照組黏膜及唾液標本均為陰性。

表1 兩組直接涂片鏡檢檢測結果

表2 兩組真菌培養與鑒定結果

2 兩組真菌培養與鑒定結果 見表2。黏膜及唾液培養鑒定組中，健康對照組黏膜標本均無菌生長，唾液標本10例無菌生長，1例菌落數為2個，平均0.18±0.60個，經鑒定為白假絲酵母菌。31例黏膜標本檢出白假絲酵母菌9例，熱帶假絲酵母菌1例，陽性率共計32.25%，在檢出假絲酵母菌的10例陽性者中，平皿菌落數在4～10個之間，平均1.94±3.22個；31例唾液標本檢出白假絲酵母菌20例，熱帶假絲酵母菌2例，陽性率為70.96%；平皿菌落數在6～22個之間，平均7.19±5.71個。均明顯高于健康對照組菌落數。本實驗均未檢出其它假絲酵母菌。統計生長的菌落數，唾液標本與黏膜及健康對照組有非常顯著性差異（P＜0.01）。

討 論

口腔假絲酵母菌病的臨床診斷主要依靠病史和臨床表現。但要確診，就必須依靠實驗室檢查，證實損害中存在病原菌。因此實驗室在為臨床提供有效性、準確性和時效性的客觀指標方面負有無可推卸的責任。實驗室真菌培養與鑒定在確定感染的發生和性質，為臨床真菌感染性疾病的診斷及治療提供準確的依據就顯得尤為重要。

本組對31例疑似口腔真菌感染的患者通過不同標本取材，不同方法涂片鏡檢及真菌培養與鑒定，得到不同的陽性率。雖然直接涂片法這類最傳統的檢測方法簡便易行，操作成本低，但陽性檢出率低。徐巖英等認為，涂片法和培養的結果有較大的誤差［2］；張利俠等也認為不同的實驗方法其敏感性和特異性差別很大，實驗受多種因素的影響，如病人選擇和實驗操作等［3］，而且涂片法不能進行菌種的鑒定，不利于臨床對癥治療。鑒于以上原因，建議臨床盡可能不使用涂片法作為口腔感染真菌的診斷依據。

由于大部分真菌是在大量使用抗生素等導致機體免疫功能下降，在其合適的條件下大量繁殖成為條件致病菌，而過度使用或濫用抗真菌藥物又會導致真菌耐藥性的增加，因此真菌感染通常比細菌感染的治療更困難。也導致近年來由真菌引起的疾病發病率呈逐年上升趨勢［4］。而且不同假絲酵母菌的致病機制、所引起的臨床癥狀、所產生的毒素種類、毒力大小均不相同，以及對抗真菌藥物的敏感性也不相同。為了使臨床醫生在抗真菌藥物種類的選擇和使用劑量上更為合理、更為科學，臨床上迫切需要微生物檢驗把真菌鑒定到種的水平［5］。因此，重視真菌種類的鑒別具有特殊意義。

雖然健康人口腔內存在假絲酵母菌，但它們和口腔中的其他正常微生物一起，形成了一個完整的生態體系，維持口腔中的生態平衡［6］，免疫系統的完整性能有效控制假絲酵母菌的感染［7］，無論是健康對照組還是口腔真菌感染者其唾液都是他們口腔內環境的真實表達。本組將唾液直接接種于沙保羅瓊脂上，31例患者中22例有菌落生長，菌落數為6～22個。所有無病損者菌落數為0～2個。說明此方法受到口腔正常寄生菌群的干擾很小，根據菌落數值其越高表示樣品中所含的細菌越多，提示與疾病的發生越相關。

目前針對口腔中假絲酵母菌的研究比較多，但是檢出率并不一致，除了不同疾病導致的口腔環境的差異外，取樣和檢測的方法不一致也是比較重要的原因。缺乏統一有效的方法，而檢出結果直接受到方法的影響，得出的結果難以進行有效的分析比較［8］。可見選擇合適的標本和方法非常重要。本研究結果顯示：唾液是理想的檢測選擇標本，將患者唾液進行真菌培養鑒定，標本便于采集，結果容易判斷，是最為簡便有效的口腔真菌感染鑒定檢測方法。

［1］劉永仙，劉曉斌，王亞萍，等.臨床感染標本1100份真菌鑒定結果及耐藥性分析［J］.陜西醫學雜志，2005，35（3）：370-371.

［2］徐巖英，胡碧瓊.口腔念珠菌病診斷的研究［J］.中華口腔醫學雜志，1993，28（6）：368-371.

［3］張利俠，歸巧娣，劉 波，等.深部真菌感染實驗室診斷技術研究進展［J］.陜西醫學雜志2009，38（5）：620-621.

［4］吳愛武.院內感染標本分離的260株念珠菌調查與分析［J］.上海醫學檢驗雜志，2000，15（3）：172-173.

［5］Willia ms DW，Lewis MA.Isolation and identification of Candida fro m the oral cavity［J］.Oral Dis，2000，6（1）：3-11.

［6］Cannon RD，Chaffin WL.Oral colo-nization by Candida albicans［J］.Crit Rev Oral Biol Med ，1999，10（3）：359-383.

［7］Ash man RB，Farah CS，Wanasaengsakul S，etal.Innate versus adap tive i mmuni-ty in Candida albicans infection［J］.Immunol Cell Biol，2004，82（2）：196-204.

［8］亓慶國，周學東，肖曉蓉，等.影響正常口腔念珠菌檢出率的方法學研究［J］.中國微生態學雜志，2004，16（1）：29-30.