大腸癌組織Runx3基因啟動子甲基化的研究

西安交通大學醫學院第一附屬醫院腫瘤科（西安710061）

徐 瑞△＃ 劉 偉＊ 李麗娜＃

Runx3基因是近年來在胃癌中發現的抑癌基因［1］，據報道至少40%的胃癌組織中Runx3基因啟動子區高甲基化，此種高甲基化狀態直接導致基因靜默，表達缺失［2］。Runx3基因啟動子甲基化具有很高腫瘤特異性，有望成為胃癌診斷的早期標記。Runx3基因是否在大腸癌的發病中起重要作用，目前尚不完全清楚。本研究中我們檢測了大腸癌中Runx3基因的表達和啟動子區甲基化狀態，探討Runx3基因啟動子甲基化與Runx3抑癌基因失活的關系及其對結腸癌發生發展的影響和意義。

材料與方法

1 組織標本 收集陜西省腫瘤醫院2009年8月至2010年12月期間手術切除的37例大腸癌組織及癌旁組織標本，其中男21例，女16例，年齡35～75歲。病例均經過2名病理科醫生確定診斷。置于液氮中速凍，-80℃保存備用。

2 細胞培養 結腸癌細胞系HT29、HCT1116為本院所保存，用含10%小牛血清的Ma COY’s 5 A完全培養基，在37℃、5%CO2的培養箱中培養。甲基轉移酶抑制劑5-aza-d C購自Sig ma公司，終濃度為5μM的5-aza-d C處理結腸癌細胞系72h，等體積的DMSO處理細胞作為溶劑對照。

3 DNA和RNA的提取 取備用的大腸癌標本約20μg研磨成粉，利用Ta Ka Ra公司的基因組DNA抽提試劑盒，按照說明書提取組織和細胞DNA，并測定其純度和濃度備用。

RNA的提取利用天根公司RNA提取試劑盒，按照說明書提取總RNA并測定其純度和濃度，利用Ta Ka Ra公司的反轉錄試劑盒獲得c DNA用于PCR模板。

4 Real time PCR 引物序列［3］為：Runx3上游5′CAGAAGCTGGAGGACCAGAC3′，下游5′GTCGGAGAATGGGTTCAGTT3′，擴增 產物為180bp；GAPDH 上游 5′GCACCGTCAAGGCTGAGAAC3′，下游 5′TGGTGAAGACGCCAGTGGA3′，擴增產物為138bp。逆轉錄合成cDNA后，利用IQ5進行Real time PCR擴增，反應條件為95℃預變性60s，變性5s，62℃退火延伸30s，40輪循環，自動設置熔解曲線。每個樣本設3個復孔。利用IQ5分析系統分析每個樣本基因表達強度，以各自GAPDH表達值為參考。

5 MSP分析Runx3基因甲基化狀態 甲基化特異PCR（MSP）：①重硫酸氫鹽修飾：取 DNA約1μg，加入終濃度0.3 mol／L的Na OH中，37℃水浴30 min；3.9mol／L亞硫酸氫鈉（PH5.0）520μl與10mmol／L對苯二酚30μl混合，加入堿變性后的DNA 50μl，覆蓋礦物油，55℃水浴18h。②模板DNA純化：經過堿基修飾的DNA用Wizard DNA純化試劑盒純化。0.3mol／L Na OH與純化DNA反應去除硫化基團，乙酸鈉、乙醇沉淀DNA，去離子水重懸，-20℃保存。③PCR擴增：采用Runx3基因特異的甲基化引物和非甲基化引物對修飾后的DNA進行擴增［4］。PCR反應總體積20μl，模板 DNA 2μl，10μmol／L上下游引物各1μl，10 mmol／Ld NTP混合物1μl，熱啟動 Taq酶1 U。98℃變性45s，63℃退火30s，72℃延伸45s，72℃延伸10 min。雙蒸水代替DNA進行PCR作陰性對照。2%瓊脂糖凝膠中電泳。

6 統計學處理 本組采用SPSS13.0統計軟件包對所有數據進行統計分析 ，計數資料比較采用卡方（χ2）檢驗，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有極顯著性差異。

結 果

1 Runx3基因mRNA水平在大腸癌組織中的表達 見圖1。Real time PCR檢測37例大腸癌及對應癌旁組織中Runx3基因的表達水平，結果顯示：大腸癌中Runx3基因表達的平均水平為1.787±0.252，低于癌旁組織中的平均表達水平（14.33±1.236）。二者具有極顯著性差異（P＜0.01）。

圖1 Runx3基因在大腸癌及癌旁組織中mRNA水平的相對表達水平

2 Runx3基因啟動子區甲基化在大腸癌中的檢測 見圖2～3。利用甲基化特異性PCR檢測大腸癌組織中Runx3基因啟動子區甲基化狀況。37例大腸癌組織中11例有甲基化產物，甲基化陽性率為30%，而僅1例癌旁組織檢測到甲基化產物，甲基化陽性率為2.7%，二者比較具有極顯著性差異（P＜0.01）。另外，在結腸癌細胞系HT29和HCT116中檢測Runx3基因甲基化狀況，結果顯示：HT29呈完全甲基化狀態；而HCT116細胞系中該基因呈非甲基化狀態。

3 甲基轉移酶抑制劑5-aza-d C能夠使Runx3基因表達復活 見圖4。Runx3基因在正常結腸黏膜組織及結腸癌細胞系HCT116中正常表達，而在結腸癌細胞系HT29中均表達靜默。經過去甲基化藥物5-azad C處理上述結腸癌細胞系后，發現Runx3基因在HT29細胞中表達明顯復活，而在HCT116中Runx3基因表達不受影響。

圖2 Runx3基因啟動子MSP檢測結果及測序圖M甲基化擴增產物；u非甲基化擴增產物；T大腸癌組織；N癌旁組織

圖3 Runx3基因甲基化水平

圖4 5-aza-d C處理細胞系后Runx3基因表達變化

討 論

既往報道顯示：Runx3基因為抑癌基因，在胃癌組織中處于失活狀態。機制研究顯示其失活機制為雜合性缺失和啟動子高甲基化［5］。因Runx3基因高甲基化具有高度的腫瘤特異性，有望成為胃癌早期診斷的生物學標志，故已成為國內外研究的熱點。國外已對胃癌、胰腺癌、膽管癌、肝癌、結腸癌、膀胱癌等作了研究，均發現不同程度Runx3基因啟動子甲基化，尤其與消化系統組織來源腫瘤密切相關，但是國內沒有在大腸癌中研究Runx3基因甲基化的系統報道。既往許多研究發現TGFβ途徑的異常在大腸癌發生發展中發揮重要作用，故我們推測作為TGFβ途徑關鍵基因的Runx3也參與大腸癌的發生。

本實驗結果提示：Runx3基因在大腸癌組織的表達水平明顯高于癌旁組織中。這種表達的差異說明Runx3基因在大腸癌中的表達降低與大腸癌的發生有關。同時，我們探討這種表達降低的機制發現30%的大腸癌組織中Runx3基因甲基化，甲基化比例與Goel等報道的比例相似［6］，Runx3基因甲基化可能是導致其表達沉默的原因之一，可能參與了大腸癌的發生。此結果與國外學者在肝癌、肺癌、胃癌、膀胱癌中所發現的Runx3甲基化存在腫瘤特異性的結果一致，推測Runx3甲基化有可能成為腫瘤診斷標記。研究發現在1例癌旁大腸黏膜組織中檢測到甲基化產物，這可能與患者年齡大有關。既往日本學者也曾經發現Runx3基因甲基化與人類的衰老存在明顯的相關性。

DNA甲基化是表觀遺傳修飾的一種重要方式，是一個可逆的過程。實驗研究中最常用到的甲基轉移酶抑制劑5-aza-d C，它通過抑制DNA甲基轉移酶的活性達到去甲基化的作用。為了研究Runx3基因甲基化敏感性，本研究中采用兩種結腸癌細胞系，結果發現在HT29細胞中Runx3呈高度甲基化狀態，5-aza-d C處理后，Runx3表達復活。這說明DNA甲基化在轉錄水平抑制Runx3基因表達，進而減少蛋白的合成。Runx3蛋白下調可能使TGFβ途徑生長抑制作用減弱，形成腫瘤。

本研究結果顯示：Runx3基因在大腸癌中的表達下降，DNA甲基化研究檢測發現Runx3基因在大腸癌中處于高甲基化狀態，提示其可能是Runx3基因下調的機制之一。由此可見Runx3基因甲基化沉默在大腸癌的發生發展中可能有一定的作用。至于其在大腸癌的早期診斷、療效檢測和預后評估中的價值及其能否作為大腸癌生物學標志仍需進一步的證實。

［1］Ito K，Liu Q，Salto-Tellez M，etal.Runx3，a novel t u mor suppressor，is frequently inactivated in gastric cancer by pr otein mislocalization［J］.Cancer Res，2005，65（17）：7743-7750.

［2］Ho mma N，Tamura G，Honda T，etal.Spreading of methylation wit hin Runx3 Cp G island in gastric cancer［J］.Cancer Sci，2006，97（1）：51-56.

［3］Cheng CK，Li L，Cheng SH，etal.Transcriptional repression of the Runx3／AML2gene by the t（8；21）and inv（16）f usion proteins in acute myeloid leukemia［J］.Blood，2008，112（8）：3391-3402.

［4］Kato N，Tamura G，Fukase M，etal.Hyper met hylation of t he Runx3 gene pro moter in testicular yolk sac t u mor of infants［J］.Am J Pathol，2003，163（2）：387-391.

［5］Li QL，Ito K，Sakakura C，etal.Causal relationship bet ween the loss of Runx3 expression and gastric cancer［J］.Cell，2002，109（1）：113-124.

［6］Goel A，Arnold CN，Tassone P，etal.Epigenetic inactivation of Runx3 in microsatellite unstable sporadic colon cancers［J］.Int J Cancer，2004，112（5）：754-759.