雞大腸桿菌區域性實時藥敏動態檢測

陶新萍 （山東省昌樂縣紅河鎮畜牧獸醫站 262411） 劉恩昌 （山東省昌樂縣畜牧獸醫局）

?

雞大腸桿菌區域性實時藥敏動態檢測

陶新萍 （山東省昌樂縣紅河鎮畜牧獸醫站 262411） 劉恩昌 （山東省昌樂縣畜牧獸醫局）

本試驗采集了泰安及周邊地區疑似大腸桿菌病、死雞的肝臟、心臟等樣品63份，按照不同時間段將其分成3組。經過細菌分離培養、染色鏡檢、生化試驗鑒定證明均為致病性大腸桿菌。按照美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS)的判定標準，對分離得到的63株大腸桿菌對12種常用抗生素進行藥敏試驗，結果表明，63株病菌對常用抗生素表現出不同程度的耐藥性，耐藥范圍較廣，不同菌株間存有較大差異，但該地區大多數菌株對克林沙星、丁胺卡那霉素高敏，而磷霉素鈉和頭孢噻肟產生了廣泛耐藥性。不同時間段分離菌的耐藥結果變化不大。

大腸桿菌病 流行病學調查 藥敏試驗 耐藥性

埃希菌(Escherichia coli)俗稱大腸桿菌(E.coli)，是埃希氏菌屬中最重要的一種細菌，屬于革蘭氏陰性兼性厭氧桿菌，一些特殊血清型的大腸桿菌對動物有致病性[1]，如某些致病性大腸桿菌能引起禽嚴重腹瀉、蜂窩織炎、腫頭綜合征、腹膜炎、輸卵管炎、滑膜炎、臍帶炎、眼炎、纖維蛋白性心包炎和敗血癥等，給養雞業帶來嚴重的經濟損失[2]。近30年來，隨著我國規模化養雞業的快速發展，禽大腸桿菌性疾病的危害越來越重，雞大腸桿菌已成為最嚴重的病原菌之一[3]，尤其是近年來抗生素在養雞業的無節制、不規范的大量應用，多重耐藥菌株廣為流行，使雞大腸桿菌病防不勝防。為有效防治某密集養殖地區的雞大腸桿菌病，特進行了雞大腸桿菌區域性實時藥敏動態檢測及高效藥物研發的研究。

腸桿菌的耐藥率大幅度上升，多重耐藥菌株劇增，耐藥譜增寬。對硫酸新霉素、氯霉素、四環素、強力霉素、氨芐青霉素、麥迪霉素、吡哌酸的耐藥率最高；對慶大霉素、卡那霉素有中等敏感性；對呋喃妥因、多粘菌素B的耐藥性最低。近年來，微生物對大多數喹諾酮類藥物的耐藥率達10%以上，我國部分地區耐藥大腸桿菌比率高達40%以上。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 培養皿，電子天平，高壓蒸汽滅菌鍋，試管，恒溫箱，冰箱，剪刀，接種環，酒精燈，無菌操作臺等。

1.1.2 試劑 藥敏試紙片(丁安卡那霉素、硫酸新霉素、鹽酸克林沙星、左旋氧氟沙星、乳酸恩諾、氟苯尼考、粘桿菌素、磷霉素納、頭孢哌舒、頭孢曲松、頭孢噻肟、阿莫西林)、麥康凱培養基、葡萄糖、乳糖、甘露醇、枸櫞酸鹽、V-P試驗、普通瓊脂、革蘭氏染色液等。

1.1.3 病料 2012年4~6月自泰安及周邊地區獸醫門診63例病死雞和病殘雞的肝臟和心臟分離病菌。

1.2 方法

1.2.1 麥康凱培養基的制備 稱取52.00g麥康凱培養基倒入錐形瓶中，加800ml去離子水,用電爐微熱,玻棒攪拌,使其完全溶解,最后定容至1000ml。將錐形瓶及培養皿洗好、晾干的培養皿包好，放入高壓蒸汽滅菌鍋進行高壓滅菌15min。滅菌后,倒入平皿(厚度3mm),冷卻后,倒置,放入4℃冰箱備用[4]。

1.2.2 細菌的分離培養 無菌采集病、瀕死雞的肝臟接種于麥康凱瓊脂培養基，放于37℃恒溫箱培養24h。

1.2.3 細菌染色、鏡檢 無菌從肝臟或心臟取病料直接涂片，染色(草酸銨結晶紫1~2min，水洗；革蘭氏碘液媒染1~3min，水洗；95%~96%酒精脫色20~30s，1min水洗；加稀釋復紅染10~30s，水洗；吸干)，顯微鏡觀察。

1.2.4 生化試驗 將純化菌株分別接種于葡萄糖、甘露醇、靛基質等生化鑒定管中，放于37℃恒溫箱培養過夜。

1.2.5 藥敏試驗 將收集大腸桿菌按時間分為3組：4.7~4.26為第1組26株，4.27~5.16為第2組21株，5.17~6.7為第3組16株。

無菌操作勾取大腸桿菌純培養菌落以劃線方式致密而均勻地涂布于普通瓊脂培養基表面。再用無菌尖頭鑷子攝取各種抗菌素藥敏試紙片，按一定密度分別貼到上述己涂布細菌的培養基表面。將貼好藥敏試紙片的平板翻轉，底部向上，置37℃恒溫箱內培養18h，取出觀察結果，并測定抑菌圈直徑，作好記錄。

2 結果

2.1 菌落形態

在麥康凱培養基上生長成光滑濕潤粉紅色圓形菌落；在普通平板培養基上生長成突起、濕潤乳白色圓形菌落。所分離的細菌均為革蘭氏陰性、兩端鈍圓的短小桿菌。

2.2 生化結果

所分離的細菌均能分解葡萄糖、乳糖、甘露醇，產酸產氣，甲基紅試驗、硝酸鹽還原試驗、靛基質試驗均為陽性，V.P均為陰性，均不能利用檸檬酸鹽，均能在三糖鐵培養基中生長，產酸產氣。

2.3 藥敏試驗

判定標準按抑菌圈直徑大小作為敏感性高低的標準。抑菌圈直徑越大表明細菌對該藥的敏感性越高。抑菌圈直徑大于20.1mm的為高度敏感；直徑在15.1~ 20.0mm者為中度敏感；直徑在6.0~15.0mm者為低度敏感或耐藥[5]。

2.3.1 第1組 對克林沙星高度敏感，丁胺卡那霉素、頭孢曲松、頭孢哌舒、硫酸新霉素高度敏感的大腸桿菌也較多，粘桿菌素、左旋氧氟沙星中度敏感，而對頭孢噻肟、磷霉素鈉、乳酸恩諾耐藥性較強。

2.3.2 第2組 對克林沙星、丁胺卡那霉素、頭孢曲松高度敏感，粘桿菌素、左旋氧氟沙星、頭孢哌舒、氟苯尼考中度敏感，而對頭孢噻肟、磷霉素鈉、乳酸恩諾耐藥性較強。

2.3.3 第3組 對克林沙星高度敏感，丁胺卡那霉素、左旋氧氟沙星、硫酸新霉素高度敏感的大腸桿菌也較多，粘桿菌素、阿莫西林、頭孢曲松中度敏感，而對頭孢噻肟、磷霉素鈉、乳酸恩諾、氟苯尼考耐藥性較強。

3 討論

表1表明大腸桿菌對克林沙星高度敏感，敏感率達60.32%，對丁胺卡那霉素、硫酸新霉素、頭孢曲松高度敏感率較高，分別是41.27%、28.57%、34.92%。對粘桿菌素、左旋氧氟沙星中度敏感分別是52.38%、31.75%。大腸桿菌對克林沙星最敏感為79.37%，對丁胺卡那霉素、頭孢曲松、粘桿菌素、硫酸新霉素也敏感，對頭孢噻肟、磷霉素鈉、乳酸恩諾耐藥性較高，藥物敏感率為9.53%、6.35%。

表1 泰安及周邊地區大腸桿菌分離菌藥物敏感率 (%)

對比發現大腸桿菌對藥物的敏感性在不斷地變化，但是大部分的藥物敏感性變化不大，克林沙星對大腸桿菌一直保持高度敏感，而硫酸新霉素、頭孢曲松、左旋氧氟沙星則敏感性變化較大，對磷霉素鈉、頭孢噻肟耐藥性較高。因此，及時實時動態檢測大腸桿菌對藥物敏感性，有利于研發高效抗菌藥物，對治療和預防大腸桿菌具有重要的實踐意義。

[1] 胡仕鳳, 雷紅宇, 寧玲忠. 雞大腸埃希菌病的診斷與防治[J]. 養禽與禽病防治, 2005. 5-15.

[2] 周霞, 王靜梅, 馬貴軍. 雞大腸埃希菌的分離鑒定及免疫預防[J]. 上海畜牧獸醫通訊. 2005. 42-43.

[3] 陳溥言主編. 獸醫傳染病學[M]. 北京: 中國農業出版社, 2008.

[4] 陳天壽主編. 微生物培養基的制備與應用[M]. 北京: 中國農業出版社, 1995.

[5] 姚火春主編. 獸醫微生物學實驗指導[M]. 北京: 中國農業出版社, 2002.

（2012–07–12）

S852.61+2

A

1007-1733(2012)12-0013-02