骨肽對成骨細胞成骨功能表達的影響

王維剛，王志剛，李大鵬

（吉林醫藥學院 附屬465醫院，吉林 吉林132013）

骨肽具有調節骨代謝、刺激成骨細胞增殖、促進新骨形成等藥理作用，多用于骨折和骨折手術愈合及風濕、類風濕關節炎的治療［1］。堿性磷酸酶（ALP）和骨鈣素（OC）是成骨細胞分泌的兩種非膠原成分。活性成骨細胞在早期發育階段細胞內就富含ALP，后期成熟階段成骨細胞可產生和分泌骨鈣素［2］，因此ALP和OC不僅是成骨細胞生長和發育早期和晚期的表型標志，同時是成骨細胞的功能狀態的體現，是骨形成指標。

本實驗研究骨肽對體外培養成骨細胞中ALP和OC表達的影響，探討骨肽在成骨細胞成骨功能中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD乳鼠購自吉林大學動物實驗中心。

1.2 主要試劑 DMEM－H培養基、胎牛血清（美國Gibco公司）；骨肽（黑龍江江世藥業有限公司）OC放射免疫試劑盒（北京中山生物技術有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 顱蓋骨分離成骨細胞 取1－3d齡小鼠乳鼠20只，無菌條件下取出顱蓋骨，PBS液清洗，置入含有DMEM培養基的培養皿中，剪成碎塊，0.25%胰蛋白酶中消化30min，37℃；血清終止消化，1.0g／LⅠ型膠原酶消化1h，37℃，2次，冷PBS終止消化，吸取上清液，1 000r／min離心8min，培養液沖洗細胞，以1×106密度將細胞懸液種植于10%小牛血清的DMEM培養基中，37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養。

1.3.2 骨肽對成骨細胞作用 骨肽按照濃度分為0.002mg／ml、0.008mg／ml、0.032mg／ml分為三個劑量，對照組加入基礎培養基。分別在1d、3d、5 d利用生化法檢測細胞培養液中ALP的含量。骨肽不同劑量繼續作用后10d和15d，利用ELISA試劑盒檢測OC含量。

2 結果

與對照組相比（見表1），骨肽濃度為0.002mg／ml時，細胞上清中ALP含量無明顯改變。隨著骨肽濃度增高，ALP的含量有增高的趨勢，0.008mg／ml組各時間點與對照組有統計學差異（P＜0.05）；0.032mg／ml劑量組各時間點與對照組相比時ALP增高更加明顯，統計學有顯著性差異（P＜0.01）。在10d與15d時間點檢測OC含量發現（見表2），與對照組相比0.002mg／ml時，OC含量無明顯改變。0.008mg／ml劑量組在兩個時間點OC含量與對照組相比有顯著增加（P＜0.05）；0.032mg／ml劑量組與對照組相比OC含量在兩個時間點有顯著性增高，尤其是10d時差異明顯（P＜0.01）。

表1 不同劑量、不同時間骨肽對成骨細胞ALP含量的影響（±s）

表1 不同劑量、不同時間骨肽對成骨細胞ALP含量的影響（±s）

＊與對照組相比P＜0.05，ΔP＜0.01

骨肽（mg／ml）ALP in osteoblasts（t／d）1 3 5對照組0.17±0.02 0.18±0.01 0.19±0.02 0.002 0.22±0.01 0.21±0.04 0.21±0.05 0.008 0.38±0.02＊ 0.37±0.03＊ 0.35±0.05＊0.032 0.45±0.02Δ 0.43±0.02Δ 0.43±0.03Δ

表2 不同劑量、不同時間骨肽對成骨細胞OC含量的影響（±s）

表2 不同劑量、不同時間骨肽對成骨細胞OC含量的影響（±s）

＊與對照組相比P＜0.05，ΔP＜0.01

0.002 0.008 0.032 10d 1.12±0.02 1.37±0.01 1.63±0.02＊ 1.71±0.02對照組 骨肽濃度（mg／ml）Δ 15d 1.08±0.01 1.27±0.04 1.44±0.05＊ 1.57±0.03＊

3 討論

成骨細胞是維持骨重建的主要細胞，它來源于骨髓間充質干細胞，功能是分泌骨基質，是骨形成過程中重要的功能細胞。在骨折愈合和骨缺損性疾病中，動員成骨細胞成骨功能，產生骨基質是治療的關鍵［3－5］。

骨肽是從中經高科技生物技術精制提取的一種新型骨病治療藥物，內含有多種與骨代謝有關的生長因子及鈣、磷等元素，具有廣泛的生物學活性，在體內可參與骨鈣的吸收和釋放，調節骨代謝的平衡，促進骨痂和新血管的形成，因此在臨床上廣泛應用于骨折和骨折疏松的治療。

本實驗利用骨肽作用于體外培養的成骨細胞，系統研究了不同濃度和不同時間點兩種關鍵的骨形成指標ALP和OC含量的變化，首次研究了骨肽成骨功能的作用特點。結果顯示：骨肽濃度在0.002 mg／ml時，各時間點ALP含量變化不明顯，考慮與骨肽濃度過低無法啟動成骨分化有關。0.008mg／ml和0.032mg／ml兩個劑量組，ALP含量表達增高，而且存在劑量依賴關系，證實骨肽濃度達到一定作用水平時可以促進成骨細胞分泌ALP。同時10 d與15d兩個時間點，在0.008mg／ml和0.032 mg／ml兩個劑量組OC明顯增高，也存在劑量依賴關系。雖然15d組在兩個濃度劑量OC含量與10 d組相比有下降的趨勢，考慮可能與在10d時已經產生足夠多的OC，而單純的依靠時間延長已經無法促進OC的產生，有關這部分的機制需要進一步的研究。

總之，骨肽能促進成骨細胞分泌產生ALP和OC，以中高劑量組促進成骨能力較為顯著。

［1］鄧利娟，任 雪，范慧紅.骨肽及復方骨肽注射液降壓物質的研究［J］.中國生化藥物雜志，2010，31（4）231.

［2］Murray J，Favus MD.Primer on the metabolic bone disease and disorders of mineral metabolism ［M］.4th ed.Philadelphia（USA）：Lippincott Williams ＆ Wilkins，1999.16－18.

［3］Caetano－Lopes J，Canhao H，Fonseca JE.Osteoblast and bone formation［J］.Acta Reumatol Port，2007，32（2）：103.

［4］Frederic Shapiro.Bone development and its relation to fracture repair：The role of mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts［J］.European Cells and Materials，2008，15：53.

［5］P.Chavassieux，E.Seeman，and P.D.Delmas.Insights into material and structural basis of bone fragility from diseases associated with fractures：How determinants of the biomechanical properties of bone are compromised by disease［J］.Endocrine Reviews，2008，28（2）：151.