Klotho基因轉染促進脂肪間充質干細胞增殖的實驗研究

韓 冬，徐 煌，鄭永霞，肖燕萍

（嘉興學院醫學院，浙江 嘉興314001）

ADSCs（adipose－derived stem cells，脂肪間充質干細胞），是一類存在于脂肪基質中，具有自我更新能力和多分化潛能的成體干細胞。ADSCs取材方便，是細胞治療的良好種子細胞來源［1］。klotho是一種抗衰老基因，其基因缺陷型動物出現多種過早衰老的癥狀，如壽命縮短、骨質疏松、皮膚肌肉萎縮、聽力下降、軟組織鈣化等［2，3］。研究發現，klotho可以影響細胞的增殖，因此本研究將klotho基因轉染至ADSCs中觀察其對ADSCs增殖能力的影響，為深入研究klotho基因功能及ADSCs作為種子細胞進行細胞治療提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑 DMEM細胞培養液購自美國GIBCO公司，碘化丙碇（PI）購自美國sigma公司，Cell Counting Kit－8（CCK－8）購自日本同仁化學研究所，兔抗人cyclinD1抗體，HRP標記的羊抗兔二抗購自北京中杉公司。轉染試劑lipofectamine2000購自美國invitrogen公司，其他化學試劑為國產分析純，質粒 pcDNA3.1－GFP、pcDNA3.1－GFP－KL 由吉林圣元科技有限公司惠贈。

1.2 ADSC的分離 取脂肪吸脂術的脂肪抽提物50mg，用PBS溶液反復沖洗3次，然后依次加入5 ml的0.5%胰酶和0.1%膠原酶，置37℃細胞培養箱內消化15min，1 000rpm離心10min后去上清，PBS沖洗3次后，低速離心，棄掉漂浮的脂肪及脂滴，200目紗網過濾，收集細胞，將分離的單細胞移入培養皿中，10%FBS的DMEM、37℃、5%CO2條件下培養。

1.3 Klotho基因的細胞轉染 將質粒pcDNA3.1－GFP和pcDNA3.1－GFP－KL （含有klotho全長基因序列）通過轉染試劑lipofectamine2000分別轉染至ADSC中，具體操作按說明書進行。在轉染后24 h、48h、96h采用 CCK－8法測定細胞增殖。將pcDNA3.1－GFP轉染組、pcDNA3.1－GFP－KL轉染組和未轉染組的ADSC細胞懸液分別調整至濃度為2.5×105／ml接種于96孔板，每孔加200μl調整好濃度的細胞懸液，37℃、5%CO2飽和濕度培養，每孔加入CCK－8溶液10μl，繼續培養2h，酶標儀上檢測各孔450nm處的OD值，以650nm波長為參考波長進行雙波長測定，以未轉染組為對照組，以pcDNA3.1－GFP轉染組、pcDNA3.1－GFP－KL轉染組為實驗組，按照公式：細胞增殖率＝實驗組（A）／對照組（A）×100% 計算細胞增殖率，比較各組間增殖率的差異。

1.4 Western blot法檢測細胞周期蛋白cyclin D1的表達 取第96h平行培養的未轉染組和pcDNA3.1－GFP轉染組、pcDNA3.1－GFP－KL轉染組的細胞，胰酶消化，含血清的培養基終止胰酶的作用，收集細胞于離心管中，細胞計數后4 000rpm離心5min，預冷PBS洗3次，棄上清，加入細胞裂解液150μl冰上孵育10min，14 000rpm離心10 min，收集上清。采用BCA蛋白定量法測定各組總蛋白濃度，取等量總蛋白在分離膠濃度為12%的條件下進行SDS－PAGE電泳，電泳結束后常規轉膜，依次用兔抗人cyclin D1的一抗和羊抗兔酶標二抗孵育，以β－actin為對照，檢測pcDNA3.1－GFP轉染組、pcDNA3.1－GFP－KL 轉染組和未轉染組cyclin D1的表達。

1.5 流式細胞儀測定ADSC的細胞周期 分別收集未轉染組和pcDNA3.1－GFP轉染組、pcDNA3.1－GFP－KL轉染組的細胞1×106個于離心管中，1 000rpm離心5min，棄上清加入1ml 70%預冷的乙醇4℃過夜。1 000rpm離心5min，棄上清，用PBS離心洗滌2次，加入1ml DNA抽提緩沖液（192ml 0.2mol／L Na2HPO4與8ml 0.1mol／L枸櫞酸的混合溶液），混勻室溫放置5min，1 000 rpm離心5min棄上清，將細胞重懸于濃度為100 mg／L的PI溶液中，室溫避光染色30min后流式細胞儀檢測。

2 結果

2.1 鏡下觀察分離和質粒轉染的ADSC形態 光鏡下觀察可見分離培養的ADSC呈貼壁生長，細胞形態為梭形，原代培養的細胞24h內即貼壁生長，轉染pcDNA3.1－GFP和pcDNA3.1－GFP－KL質粒的ADSC在熒光顯微鏡下呈現綠色熒光，證明質粒已成功轉染入ADSC中，見圖1。

圖1 分離及轉染后ADSC的細胞形態

2.2 CCK－8法測定細胞增殖 測定吸光度值后計算各組增殖率，pcDNA3.1－GFP－KL組與未轉染組相比ADSC的增殖率在第24h、48h、96h分別為124.75%、140.52%、175.50%。而 pcDNA3.1－GFP組與未轉染組相比的增殖率在第24h、48h、96h分別為100.99%、101.29%、100.22%，細胞增殖率與對照組相比無明顯差異，各組吸光度結果見表1，細胞形態見圖2。

2.3 cyclinD1蛋白的表達western blot結果顯示pcDNA3.1－GFP－KL轉染組與 pcDNA3.1－GFP轉染組和未轉染組相比cyclin D1蛋白的表達水平明顯增高，結果見圖3。而轉染pcDNA3.1－GFP組和未轉染組相比cyclinD1蛋白的表達水平無明顯差異，而3組細胞的β－actin蛋白的表達無明顯差異。

表1 各組細胞不同時間的吸光度值

圖2 未轉染組及轉染組96hADSC的細胞形態

圖3 western blot檢測各組細胞cyclinD1的表達

2.4 流式細胞儀檢測細胞周期 未轉染組、pcDNA3.1－GFP－KL轉染組和pcDNA3.1－GFP轉染組的細胞周期分析結果顯示，pcDNA3.1－GFP－KL轉染組G0／G1期的細胞明顯減少（P＜0.05），而S期細胞明顯增多（P＜0.05），G2／M 期細胞也增多（P＜0.05），而未轉染組和pcDNA3.1－GFP轉染組的細胞周期分析無明顯差異，結果見表2。

表2 流式細胞儀測定各組細胞的細胞周期

3 討論

人klotho基因位于17號染色體的大臂，全長5.2kb，由5個外顯子和4個內含子組成［4］。Klotho是一種抗衰老基因，研究發現klotho基因發生突變可導致動物出現過早衰老癥狀及壽命縮短，而過表達klotho基因的小鼠則出現衰老抑制和壽命延長［5］。Klotho基因通過雙向作用發揮抗衰老的作用，體現為一方面抑制腫瘤細胞增殖，另一方面促進正常細胞增殖。已有研究證實Klotho基因可抑制IGF－1信號通路進而抑制腫瘤細胞增殖，而klotho基因也可抑制過量的維生素D引起的細胞凋亡，激活細胞的有絲分裂來發揮其促進正常細胞增殖作用［6，7］。klotho隨著年齡的增長和某些疾病條件下其表達呈下降趨勢。在自發性高血壓大鼠和糖尿病大鼠中持續的高壓和氧化應激使klotho表達明顯下降，在人慢性腎臟疾病中klotho表達也呈下降趨勢［8－10］，因此采用klotho基因轉染的手段，可以提高klotho在細胞的表達量，進而達到促進細胞增殖及抗衰老的目標。

ADSCs（adipose－derived stem cells，脂肪間充質干細胞），是一類存在于脂肪基質中，具有自我更新能力和多分化潛能的成體干細胞，研究證實它可分化為脂肪細胞、心肌細胞、成骨細胞、神經細胞等多種成體細胞。ADSCs可從吸脂術中的廢棄脂肪中分離，取材極為方便，ADSC認為是替代骨髓間充質干細胞用于細胞移植的理想種子細胞。ADSC在體外培養時，血清濃度、細胞密度等培養條件對其增殖能力影響較大。在既往研究中，我們發現ADSC增殖周期為1w左右，如能提高ADSC的體外增殖能力，在體外大量擴增ADSC，將為ADSC作為種子細胞進行細胞移植、構建工程化組織提供實驗基礎。

本研究中使用細胞轉染手段，將Klotho基因轉染至培養的ADSC中，通過CCK－8檢測細胞增殖能力，實驗結果為在轉染后96hpcDNA3.1－GFP－KL轉染組的增殖能力為未轉染組的175.50%，而通過流式細胞儀檢測細胞周期發現，轉染klotho基因后ADSC在靜止期（G0／G1期）細胞數明顯減少，而合成期 （S期）和有絲分裂期 （G2／M期）的細胞數明顯增多，說明ADSC轉染klotho基因后細胞的增殖能力明顯增強，而通過免疫組化的測定結果發現，ADSC中cyclinD1蛋白的表達在轉染klotho基因后明顯增高，而cyclinD1蛋白也是使細胞進入合成期，促進細胞增殖的必要條件，以上實驗結果均說明轉染klotho基因可增強體外培養ADSC的增殖能力。

Klotho作為抗衰老基因，其研究尚處于起步階段，其發揮抗衰老促進正常細胞增殖的分子機制有待深入研究。本研究采用轉染klotho基因的方法提高了ADSC體外增殖能力，為進一步研究klotho基因抗衰老的機制和將ADSCs用于細胞移植治療疾病打下實驗基礎。

［1］Casteilla L，Planat－Benard V，Laharrague P，et al.Adipose－derived stromal cells：Their identity and uses in clinical trials，an update［J］.World J Stem Cell，2011，3（4）：25.

［2］Kuro－o M，Matsumura Y，Aizawa H，et al.Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling ageing［J］.Nature，1997，390：45.

［3］Arking DE，Krebsova A，Macek M，et al.Association of human aging with a functional variant of klotho［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99：856.

［4］Matsumura Y，Aizawa H，Shiraki－Iida T，et al.Identification of the human klotho gene and its two transcripts encoding membrane and secreted klotho protein［J］.Biochem Biophys Res Commun，1998，242：626.

［5］Ogata N，Matsumura Y，Shiraki M，et al.Association of klotho gene polymorphism with bone density and spondylosis of the lumbar spine in postmenopausal women［J］.Bone，2002，31：37.

［6］Tatar M，Bartke A，Antebi A.The endocrine regulation of aging by insulin－like signals［J］.Science，2003，299：1346.

［7］Tsujikawa H，Kurotaki Y，Fujimori T，et al.Klotho，agene related to a syndrome resembling human premature aging，functions in a negative regulatory circuit of vitamin D endocrine system［J］.Mol Endocrinol，2003，17：2393.

［8］Nabeshima Y.Ectopic calcification in Klotho mice［J］.Clin Calcium，2002 ，12（8）：1114.

［9］Zhao Y，Banerjee S，Dey N，et al.klotho depletion contributes to increased inflammation in kidney of mouse of diatetes via ReIA 536phosphorylation［J］.Diabetes，2011，60（7）.1907.

［10］Koh N，Fujimori T，Nishiguchi S，Tamori A，Shiomi S，Nakatani T，Sugimura K，Kishimoto T，Kinoshita S，Kuroki T，Nabeshima Y.Severely reduced production of klotho in human chronic renal failure kidney［J］.Biochem Biophys Res Commun，2001，280：1015.