利用等位基因特異性擴(kuò)增檢測(cè)人結(jié)直腸癌BRAF基因V600E突變

司徒博，曹楠楠，劉麗琴，李 博，劉芹蘭，林 麗，王 前，鄭 磊＊

（1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，廣東 廣州510515；2.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科，廣東 廣州510010）

RAS／RAF／MEK／ERK／MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等多種生物學(xué)事件。BRAF基因的編碼產(chǎn)物的是參與該通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的一種重要絲氨酸／蘇氨酸激酶，該基因的15外顯子1799位核苷酸的T→A突變是BRAF基因的熱點(diǎn)突變（約占80%－90%）［1］，此突變使其編碼的氨基酸由纈氨酸變?yōu)楣劝彼幔╒600E），導(dǎo)致該激酶活性大大增強(qiáng)，能持續(xù)激活MAPK信號(hào)通路，致使細(xì)胞異常增殖及分化，被認(rèn)為是細(xì)胞癌變的關(guān)鍵因素［2，3］。在結(jié)直腸腫瘤治療中，BRAF V600E突變情況被認(rèn)為是除KRAS突變外對(duì)分子靶向藥物西妥昔單抗與帕尼單抗的療效預(yù)測(cè)的另外一個(gè)重要指標(biāo)［4，5］。此外，突變的BRAF基因也是結(jié)直腸腫瘤預(yù)后較差的一個(gè)生物標(biāo)志物［6］，以及區(qū)分散發(fā)性結(jié)直腸癌與Lynch綜合征的分子指標(biāo)［7］。因而，準(zhǔn)確檢測(cè)腫瘤組織中BRAF基因的突變情況具有重要的診療意義。本研究以人BRAF基因V600E突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)等位基因特異性擴(kuò)增引物，通過(guò)選擇性擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)檢測(cè)BRAF基因熱點(diǎn)突變的目的，通過(guò)與金標(biāo)準(zhǔn)Sanger測(cè)序法比較，探討該方法的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人大腸癌SW480及HT29細(xì)胞分別由南方醫(yī)院消化科及廣州軍區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科惠贈(zèng)。兩株細(xì)胞均經(jīng)過(guò)測(cè)序證實(shí)分別為BRAF野生型及攜帶BRAF V600E雜合突變。

1.1.2 結(jié)直腸癌標(biāo)本 40例結(jié)直腸癌石蠟標(biāo)本來(lái)源于廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院病理科。所有提取DNA腫瘤組織切片均經(jīng)鏡檢證實(shí)腫瘤細(xì)胞含量大于90%。

1.1.3 試劑與儀器 細(xì)胞核酸提取試劑盒（美國(guó)Omega公司），石蠟組織核酸提取試劑盒（德國(guó)Qiagen公司），TaKaRa TaqTM試劑盒（日本TaKaRa公司），瓊脂粉（西班牙Biowest公司）。Nanodrop2000分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo公司），PCR儀（德國(guó)Eppendorf公司），凝膠成像儀（美國(guó)Bio－Rad公司）。

1.1.4 引物設(shè)計(jì)及合成 針對(duì)人BRAF基因V600E位點(diǎn)設(shè)計(jì)3’末尾堿基錯(cuò)配的上游引物：TGATTTTGGTCTAGCTACAGA，下游引物：TTTCAACAGGGTACACAGAACA，下劃線堿基與BRAF野生型模板15外顯子1799位堿基錯(cuò)配，與突變熱點(diǎn)V600E匹配而達(dá)到選擇性擴(kuò)增的目的，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為490bp。測(cè)序引物擴(kuò)增范圍覆蓋BRAF基因第15外顯子V500E突變位點(diǎn)：上游引物：AGATCTACTGTTTTCCTTTACTTACTACACC，下游引物：AATCAGTGGAAAAATAGCCTCAATTCT，擴(kuò)增片段184bp。所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成 ，PAGE純化。

1.2 方法

1.2.1 核酸提取 分別用細(xì)胞核酸提取試劑盒及石蠟組織核酸提取試劑盒對(duì)細(xì)胞及腫瘤標(biāo)本進(jìn)DNA提取，模板DNA置－20℃保存。

1.2.2 等位基因特異性擴(kuò)增 對(duì)人大腸癌細(xì)胞株SW480、HT29以及40例腫瘤標(biāo)本進(jìn)行等位基因特異性擴(kuò)增，條件如下：PCR體系總體積為20μl，含Mg2＋buffer 2μl，dNTP mixture 1.5μl（各 2.5 mM），上下游引物各0.5μl（10umol），模板 DNA 30ng，加滅菌去離子水至20μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30s；95℃變性10s，67℃退火20s，72℃延伸30s，共45個(gè)循環(huán)。腫瘤標(biāo)本取1μl第一次擴(kuò)增產(chǎn)物作為進(jìn)行二次擴(kuò)增，擴(kuò)增條件一致。PCR產(chǎn)物取5μl進(jìn)行瓊脂糖（2%）凝膠電泳30min后顯像。

1.2.3 普通PCR并測(cè)序 所有標(biāo)本及細(xì)胞株均經(jīng)PCR后測(cè)序與等位基因特異性擴(kuò)增結(jié)果作比較。PCR反應(yīng)條件：含 Mg2＋buffer 2μl，dNTP mixture 1.5μl（各2.5mM），上下游引物各1μl（10μmol），模板DNA 30ng，加滅菌去離子水至20μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30s；95℃變性10s，54℃退火20s，72℃延伸30s，共40個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖（2%）凝膠電泳證實(shí)目的條帶擴(kuò)增成功后送測(cè)序（華大基因有限公司）。

1.2.4 靈敏度檢測(cè) 取SW480及 HT29細(xì)胞株DNA經(jīng)核酸定量?jī)x均定量為30ng后，按一定比例用攜帶有BRAF野生型（SW480）的核酸混合到帶有BRAF V600E突變（HT29）的核酸中，得到分別含有50%、25%、12.5%、6.2%、3.1%、1.5%的突變DNA的混合模板，分別取30ng進(jìn)行等位基因特異性擴(kuò)增與普通PCR后測(cè)序進(jìn)行靈敏度比較。

2 結(jié)果

2.1 等位基因特異性擴(kuò)增BRAF V600E突變結(jié)果 在上述PCR條件下，該方法成功選擇擴(kuò)增出攜帶有BRAF V600E雜合突變的細(xì)胞株（圖1）。而在40例大腸癌石蠟標(biāo)本中，3例出現(xiàn)了目的擴(kuò)增產(chǎn)物（圖2）。

圖1 不同比例的BRAF V600E突變核酸經(jīng)等位基因特異性擴(kuò)增后行瓊脂糖凝膠電泳

圖2 利用等位基因特異性擴(kuò)增檢測(cè)40例大腸癌石蠟標(biāo)本

2.2 普通PCR后測(cè)序結(jié)果 40例大腸癌石蠟標(biāo)本經(jīng)成功擴(kuò)增后送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示40例標(biāo)本中37例BRAF基因15外顯子1799位核苷酸為野生型，3例為BRAF V600E突變，檢測(cè)結(jié)果與等位基因特異性擴(kuò)增結(jié)果一致。

2.3 兩種方法靈敏度比較 如圖1顯示，通過(guò)等位基因特異性擴(kuò)增不同比例突變核酸，本方法可在6.2%的突變基因模板中擴(kuò)增出目的條帶，顯示本方法檢測(cè)BRAF V600E突變的敏感度可低至6.2%。普通PCR后測(cè)序結(jié)果則能從峰圖中顯出50%、25%、12.5%的突變位點(diǎn)，低于12.5%則與背景信號(hào)混雜無(wú)法測(cè)出（圖3）。

圖3 不同比例的BRAF V600E突變核酸經(jīng)普通PCR后測(cè)序的信號(hào)峰圖

3 討論

腫瘤是由于細(xì)胞在致癌因素的影響下發(fā)生基因變異，從而失去對(duì)生長(zhǎng)的正常調(diào)控而導(dǎo)致的單克隆性異常增生所致。其中，被認(rèn)為對(duì)腫瘤形成起重要作用的突變被稱為“驅(qū)動(dòng)突變”（Driver Mutation），準(zhǔn)確、敏感地檢測(cè)該類突變可作為腫瘤的生物標(biāo)志物從而對(duì)腫瘤的分子診斷提供重要信息。BRAF V600E突變已被證實(shí)出現(xiàn)于甲狀腺癌、大腸癌、惡性黑素瘤、肺癌、毛細(xì)胞白血病等多種腫瘤中［8］，在腫瘤的早期診斷、鑒別診斷、預(yù)后判斷以及分子分型中起了重要作用。近年來(lái)，隨著分子靶向藥物的不斷研發(fā)，作用于BRAF突變蛋白的靶向藥物也陸續(xù)進(jìn)入臨床。目前該基因突變情況被認(rèn)為是對(duì)大腸癌［9］、惡性黑素瘤［10］分子靶向藥物療效預(yù)測(cè)的重要指標(biāo)而受到人們的日益重視。由于靶向藥物往往價(jià)格昂貴且毒副作用明顯，因而準(zhǔn)確、敏感地檢測(cè)出判斷其療效的基因突變情況具有重要的指導(dǎo)意義。然而，眾多晚期腫瘤患者初診時(shí)已失去手術(shù)機(jī)會(huì)，檢測(cè)腫瘤源性的突變基因情況只能通過(guò)穿刺組織活檢、胸腹水等檢測(cè)。該類標(biāo)本腫瘤細(xì)胞豐度低且混雜了大量正常的體細(xì)胞，即使是腫瘤組織本身，也常混雜了大量野生型的體細(xì)胞。目前檢測(cè)突變的常用方法有測(cè)序、RFLP（限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性）、SSCP（單鏈構(gòu)象多態(tài)性）、熒光定量PCR、dHPLC（變性高效液相色譜）、HRM（高分辨率溶解曲線）等，RFLP與SSCP存在步驟繁瑣、敏感性欠佳的缺點(diǎn)；定量PCR、HRM及dHPLC均需要特殊設(shè)備或標(biāo)記探針；被認(rèn)為是基因檢測(cè)“金標(biāo)準(zhǔn)”的測(cè)序法往往需要昂貴的測(cè)序儀器及較復(fù)雜操作要求，且成本較高、操作耗時(shí)，一般實(shí)驗(yàn)室難以開(kāi)展。此外，臨床上利用測(cè)序作為檢測(cè)方法實(shí)驗(yàn)室為避免假陰性，往往拒收腫瘤細(xì)胞含量低于50%的標(biāo)本，導(dǎo)致了一部分晚期腫瘤病人對(duì)靶向治療選擇無(wú)據(jù)可循。

等位基因特異性擴(kuò)增是檢測(cè)已知突變的一種簡(jiǎn)便方法，該方法利用Taq酶缺少3’→5’外切酶活性，引物3’末端堿基與模板錯(cuò)配時(shí)，擴(kuò)增難以進(jìn)行的原理，而達(dá)到選擇性擴(kuò)增定點(diǎn)突變或野生型基因的目的。本研究通過(guò)設(shè)計(jì)上游引物3’端與BEAF基因V600E點(diǎn)突變完全互補(bǔ)、與野生型堿基錯(cuò)配的上游引物，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，從而達(dá)到選擇性擴(kuò)增BRAF V600E突變的目的。通過(guò)利用攜帶V600E突變的HT29細(xì)胞與BRAF野生型的SW480大腸癌細(xì)胞株的模板稀釋實(shí)驗(yàn)，證實(shí)該方法可檢測(cè)出混雜于野生型中的6.2%BRAF突變，與測(cè)序相比（12.5%）本方法具有更高的靈敏度。利用本研究建立方法檢測(cè)40例大腸癌石蠟標(biāo)本，成功檢測(cè)出3例，與PCR后測(cè)序結(jié)果對(duì)比一致。

綜上所述，等位基因特異性擴(kuò)增可快速檢測(cè)出腫瘤BRAF基因V600E突變，與測(cè)序法相比，本方法無(wú)需特殊設(shè)備，具有簡(jiǎn)便、快捷、靈敏、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，較適合普通實(shí)驗(yàn)室對(duì)腫瘤突變基因的篩查檢測(cè)。

［1］Kumar R，Angelini S，Czene K，et al.BRAF mutations in metastatic melanoma：apossible association with clinical outcome［J］.Clin Cancer Res，2003，9：3362.

［2］Balmanno K，Cook SJ.Tumour cell survival signalling by the ERK1／2pathway［J］.Cell Death Differ，2009，16：368.

［3］Wickenden JA，Jin H，Johnson M，et al.Colorectal cancer cells with the BRAF（V600E）mutation are addicted to the ERK1／2 pathway for growth factor－independent survival and repression of BIM［J］.Oncogene，2008，27：7150.

［4］Amado R G，Wolf M，Peeters M，et al.Wild－type KRAS is required for panitumumab efficacy in patients with metastatic colorectal cancer［J］.J Clin Oncol，2008，26：1626.

［5］Di Nicolantonio F，Martini M，Molinari F，et al.Wild－type BRAF is required for response to panitumumab or cetuximab in metastatic colorectal cancer［J］.J Clin Oncol，2008，26：5705.

［6］Yokota T，Ura T，Shibata N，et al.BRAF mutation is a powerful prognostic factor in advanced and recurrent colorectal cancer［J］.Br J Cancer，2011，105：856.

［7］Domingo E，Laiho P，Ollikainen M，et al.BRAF screening as a low－cost effective strategy for simplifying HNPCC genetic testing［J］.J Med Genet，2004，41：664.

［8］Davies H，Bignell GR，Cox C，et al.Mutations of the BRAF gene in human cancer［J］.Nature，2002，417：949.

［9］Loupakis F，Ruzzo A，Cremolini C，et al.KRAS codon 61，146and BRAF mutations predict resistance to cetuximab plus irinotecan in KRAS codon 12and 13wild－type metastatic colorectal cancer［J］.Br J Cancer，2008，101：715.

［10］Paul BC，Axel H，Caroline R，et al.Improved Survival with Vemurafenib in Melanoma with BRAF V600EMutation［J］.N Engl J Med，2011，364：2507.