白藜蘆醇對人腎細胞癌786－0細胞PDCD5表達的影響

單中杰，魏金星＊，韓前河，侯箐嵐

（1.鄭州大學第一附屬醫院 泌尿外科，河南 鄭州450052；2.鄭州人民醫院 泌尿外科，河南 鄭州450003）

白藜蘆醇是從葡萄、花生、虎杖等藥用植物中提取的一種酚類化合物。近來研究［1］發現RES有抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗氧化、神經保護等作用。深入研究［2，3］發現其具有抗腫瘤作用，可顯著抑制前列腺癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、腸癌、甲狀腺癌、垂體腺瘤等多種腫瘤細胞的生長。人程序化死亡分子5（the human programmed cell death 5，PDCD5）基因是由北京大學疾病研究中心在國際上首先從人白血病細胞株株TF－1細胞中克隆得到的凋亡相關新基因［5］。PDCD5在人體50多種組織中表達并參與細胞凋亡過程的調控［4－7］。體外實驗表明，PDCD5可促使多種腫瘤細胞凋亡，且對放、化療有協同作用。研究表明［8－11］PDCD5在撤除細胞因子、撤除血清、化療藥物處理等誘導因素，能顯著抑制多種癌細胞在體外的生長，明顯促進其凋亡。有關白藜蘆醇上調PDCD5的表達來誘導腎細胞癌細胞凋亡的研究，至今國內外未見文獻報道。本實驗旨在探討RES對人腎細胞癌細胞株786－0體外生長的影響及可能機制，為其用于腎細胞癌的臨床治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人腎細胞癌細胞株786－0，中科院上海細胞生物學研究所。

1.1.2 主要試劑和儀器 白藜蘆醇（純度為99%）購自美國Sigma公司；二甲基亞砜，Sigma公司；流式細胞儀，德國Partec公司；DMEM培養液，美國HyClone公司；胎牛血清，北京中杉生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 細胞用含有20%胎牛血清，1×105U／L青霉素、鏈霉素的DMEM高糖培養液在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養。

1.2.2 免疫細胞化學檢測PDCD5蛋白表達情況取對數生長期的人腎細胞癌786－0細胞，調整細胞密度為1×105個／ml，接種于24孔板中（每培養孔放置直徑4mm×4mm的無菌蓋玻片），每孔1 ml，細胞貼壁生長后，吸除培養板中的培養液，按實驗分組加入稀釋好的含白藜蘆醇濃度分別為12.5 μmol／L、25μmol／L、50μmol／L、100μmol／L 的培養液，空白對照組加入同體積的培養液，繼續培養，培養24h后取出固定。按照SP試劑盒說明書進行操作。對照組PBS替代一抗作為空白對照。免疫細胞化學檢測以細胞漿內有棕色顆粒樣物質視為免疫陽性細胞。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞周期 收集對數生長期的細胞，分別用 12.5μmol／L、25μmol／L、50 μmol／L、100μmol／L的白藜蘆醇，處理細胞24h，并設空白對照組。離心收集，調整細胞濃度為1×106個／ml各取1ml，PBS離心洗滌2次后，棄上清，加終濃度為70%的冰乙醇，置4℃冰箱固定過夜。檢測時再用PBS離心洗滌2次后，PI復合染液暗處染色20min后上流式細胞儀檢測并分析細胞周期分布。實驗重復3次。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡 收集對數生長期的細胞，分別用 12.5μmol／L、25μmol／L、50 μmol／L、100μmol／L的白藜蘆醇，處理細胞24h，并設空白對照組。離心收集，調整細胞濃度為1×106個／ml各取1ml，PBS離心洗滌2次后，棄上清，PBS洗滌樣品細胞后，以稀釋的結合緩沖液重懸細胞（用蒸餾水1：4稀釋結合緩沖液），并調整細胞濃度為2－5×105／ml，取195μl細胞懸液，加入5μl Annexin－V－FITC混勻，室溫反應10min，PBS洗滌一次，再以190μl稀釋的結合緩沖液，加入10μl的120μl／ml PI，用流式細胞儀分析，每個樣本收集20×103個細胞熒光信號，采用Cellquest軟件分析結果。實驗重復3次。

1.2.5 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件進行方差分析，計量資料用±s表示；兩組均數的比較用t檢驗（t－test），方差不齊時先進行變量轉換。以α＝0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 Res作用后人腎細胞癌786－0細胞形態的變化

正常情況下人腎細胞癌786－0細胞生長良好，呈梭形，圓形或多邊形，細胞輪廓清晰。不同濃度的Res作用于人腎細胞癌786－0細胞后可見細胞形態縮小、變圓、核固縮、碎裂，細胞內出現顆粒樣物質，懸浮細胞增多（圖1）。

圖1 RES對人腎細胞癌786－0細胞生長的影響（200X）

2.2 Res對人腎細胞癌786－0細胞PDCD5蛋白表達的影響

Res能明顯上調人腎細胞癌786－0細胞PDCD5蛋白的表達，4種不同濃度的白藜蘆醇作用于人腎細胞癌786－0細胞24h后PDCD5蛋白表達均較空白對照組有所升高，同一時段內隨著濃度增加，PDCD5蛋白表達增高，RES組與空白對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.05），各實驗組之間兩兩相比，12.5μmol／L與25、50、100μmol／L比較，P均＜0.05；但25μmol／L 與50、100μmol／L比較，P均＞0.05（表1、圖2）。

表1 白藜蘆醇對人腎細胞癌786－0細胞中PDCD5蛋白表達的影響（±s）

表1 白藜蘆醇對人腎細胞癌786－0細胞中PDCD5蛋白表達的影響（±s）

注：空白對照組比較，＊P＜0.05；與12.5μmol／L比較，△P＜0.05

Resveratrol μmol／L Action time（t／h）24 48 72 0 1.10±0.19 1.13±0.21 1.42±0.25 12.5 1.43±0.32＊ 1.57±0.14＊ 1.73±0.34＊25 2.90±0.13＊Δ 3.08±0.21＊Δ 3.23±0.21＊Δ 50 3.06±0.11＊Δ 3.18±0.23＊Δ 3.25±0.20＊Δ 100 3.17±0.45＊Δ 3.22±0.48＊Δ 3.30±0.46＊Δ

圖2 RES對人腎細胞癌786－0細胞PDCD5的影響（200X）

2.3 Res對人腎細胞癌786－0細胞周期的影響

人腎細胞癌786－0細胞在Res作用24h后，隨著濃度的增高G1期及G2期比例顯著下降，S期比例明顯升高；不同濃度的Res對腎細胞癌細胞均有明顯的抑制作用，表現為G1期及G2期細胞比例明顯降低，S期比例明顯升高。Res各濃度與對照組比較，P均 ＜0.05；12.5μmol／L 與 25、50、100 μmol／L比較，P均＜0.05（表3）；但25μmol／L與50、100μmol／L比較，P均＞0.05（表2）

表2 不同濃度Res對腎細胞癌細胞周期分布的影響（±s%）

表2 不同濃度Res對腎細胞癌細胞周期分布的影響（±s%）

注：空白對照組比較，＊P＜0.05；與12.5μmol／L比較，△P＜0.05

Res濃度（μmol／L） G1期 S期 G2期0 75.23±2.58 13.17±1.36 11.35±2.37 12.5 73.19±3.63＊ 16.48±3.43＊ 10.16±0.25＊25 65.28±3.10＊△ 24.79±3.72＊△ 9.67±0.43＊△50 57.89±4.33＊△ 33.42±3.36＊△ 8.76±0.87＊△100 48.69±5.88＊△ 43.61±1.67＊△ 7.88±0.78＊△

2.4 Res對人腎細胞癌786－0細胞凋亡的影響

FCM檢測白藜蘆醇作用人腎細胞癌786－0細胞24h后，顯著提高人腎細胞癌786－0細胞的凋亡率，與對照組相比，12.5，25，50，100μmol／L白藜蘆醇組凋亡率明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖3）。

圖3 流式細胞儀檢測RES對人腎細胞癌786－0細胞凋亡的影響（24h）

3 討論

白藜蘆醇（Res），屬非黃酮類多酚化合物，分子式是C14H12O5，化學結構式是3，5，4’—三羥基—反—二苯乙烯，是植物在受到外來侵害時所產生的一種抗毒素。Res藥理作用廣泛，現已發現［1］的藥理作用包括有抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗氧化、神經保護、抗腫瘤活性等。目前已有多項動物試驗和體外試驗結果［1，3，7，9］表明，Res對某些癌癥，如結腸癌、乳腺癌、肺癌等具有一定的抗癌作用，但具體機制還不是很清楚。深入研究［3］發現Res通過抑制細胞增殖，對細胞周期的影響表現出易變性。Res顯著抑制食道癌增殖，使細胞G0／G1期細胞比例顯著升高，S期比例明顯下降，使細胞停止于G1期。Ahmad［12］等發現Res能誘導CDK抑制蛋白 WAF1／p21的表達，使上皮樣癌細胞（A431）停頓于S期。

近來研究發現，PDCD5在肝癌［13］、乳腺癌［14］、甲狀腺乳頭狀癌［15］、宮頸癌［16］中表達下降，且與腫瘤的惡性度呈負相關。同時研究表明［8－11］PDCD5在化療藥物處理等誘導因素的作用下，能顯著抑制多種癌細胞在體外的生長，明顯促進其凋亡。但目前尚未發現Res對人腎細胞癌786－0細胞的生長和PDCD5表達影響的報道。本實驗通過不同濃度Res對人腎細胞癌786－0細胞的生長和PDCD5的轉錄和翻譯的影響，觀察腎細胞癌細胞的生長、凋亡和PDCD5的蛋白和mRNA的表達情況。本實驗結果發現不同濃度的Res作用人腎細胞癌786－0細胞24h，隨著RES的濃度增高，凋亡細胞數逐漸增加，而PDCD5蛋白的表達強度明顯增高，流式細胞儀檢測發現典型凋亡峰，與空白對照組比較，實驗組凋亡率顯著增高，隨著濃度的增加G1期及G2期比例顯著下降，S期比例明顯升高，將人腎細胞癌786－0細胞阻滯于S期、誘導細胞凋亡。

本研究結果表明，RES能明顯抑制體外培養的人腎細胞癌細胞的生長并促使其發生凋亡，且濃度為25μmol／L時，抑制作用最強。其機制可能與RES誘導PDCD5蛋白表達增加有關，但其抑制腎細胞癌的作用及其具體機制仍需進一步深入探討。

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