T24膀胱癌細胞ARID1A基因的表達與細胞增殖活力相關性研究

吳金斌，漆正宇，晏耀明，翟慶娜，余振東

（1.北京大學深圳醫院 檢驗科，2.北京大學深圳醫院 男性生殖與遺傳重點實驗室，廣東 深圳518036）

膀胱癌是一類常見的泌尿系統惡性腫瘤，其中移行細胞癌占膀胱癌發病率的90%以上［1］。染色質重建復合物SWI／SNF亞基AT豐富結合域1A基因（AT rich interactive domain 1A，ARID1A）是近兩年來腫瘤研究關注的一個重要基因，膀胱移行細胞癌中ARID1A高比率突變［2］，但我們前期測序發現在膀胱癌細胞系T24中ARID1A可以正常表達。ARID1A作為一個染色質重建復合物亞基基因，跟細胞增殖密切相關［3］。本研究通過有限稀釋方法分離出膀胱移行細胞癌細胞系T24的高增殖活力亞克隆細胞株，體外評價ARID1A表達與細胞增殖轉移潛能關系，并為進一步研究ARID1A基因功能提供目的細胞。

1 材料和方法

1.1 材料

基礎培養基 H－DMEM（Gibco USA），10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，Gibco USA），左旋谷氨酰胺（Gibco USA），青霉素和鏈霉素合劑（Invitrogen USA），胰 酶 （Gibco，USA），Trizol（Invitrogen，USA），CellTiter 96○RAQueous One Solution Cell Proliferation Assay（a）（Promega，USA），Platinum○RSYBR○RGreen qPCR SuperMix UDG kit（Invitrogen，USA）。

1.2 方法

1.2.1 T24細胞培養 T24細胞系為本實驗室保存，傳代培養。培養基包括90% 基礎培養基HDMEM，和10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），同時添加1mmol／L左旋谷氨酰胺、100U／ml青霉素和100μg／ml鏈霉素合劑。細胞消化采用0.25%胰酶。在培養基中添加10%體積FBS和8%DMSO配成凍存液，按常規流程液氮凍存細胞。

1.2.2 高增殖亞克隆細胞株形成 將生長旺盛的T24細胞從培養皿消化后，稀釋到1×102個／ml，以1／2濃度梯度稀釋接種到96孔板中，5h內在倒置顯微鏡下觀察，標記單細胞孔，第10天將從單細胞擴增形成的細胞亞克隆傳至24孔板，得到亞克隆細胞株。亞克隆細胞株傳代培養至第3代，均一化接種培養并每天計數顯微鏡視野細胞數，估測篩選高增殖細胞株。

1.2.3 細胞增殖活力比較 采用CellTiter 96○RAQueous One Solution Cell Proliferation Assay（a）試劑，MTS法檢測亞克隆細胞與T24親代細胞增殖活力，分別在1、3、5和7天選擇時間點檢測。

1.2.4 RT－qPCR 檢測 采用常規 Trizol試劑提取細胞RNA。逆轉錄反應采用Fementas ReverseAid First Strand cDNA Synthesis Kit，反應體系為20μl。采用 Platinum○RSYBR○RGreen qPCR SuperMix UDG kit對目的基因進行qPCR相對定量，比較細胞增殖相關基因CCND1（cyclin D1）表達，并通過定量膀胱癌腫瘤干細胞標志基因CD44來進一步驗證細胞增殖特性。定量ARID1A在不同增殖活力細胞中的表達。目的基因及內參GAPDH 跨外顯 子正反 向引物序列 （5′－3′）為：CCND1（sense：FGCATCTACACCGACAACTCCA ，antisense：GCACAGAGGGCAACG AAG）；CD44（sense：GTTCCTGGACTGAT，antisense：AATTACTCTGCTGCG TTG）；ARID1A（sense：AGGACGGAGCCTGGAATA，antisense：CCTTGGGTG GAGAACTG A）；GAPDH（sense：ATCATCAGCAATGCCTCC，antisense：CAT CACGCCACAGTTTCC）。PCR反應條件為94℃20sec，55℃20sec，72℃20sec，共35個循環。

2 結果

2.1 獲得高增殖亞克隆細胞株T24－9

T24分離得到65株亞克隆細胞，其中T24－9細胞株培養計數表現出較強的增殖活力。

2.2 T24－9細胞形態學特征

T24－9體積較親代T24明顯偏小，與T24的紡錘形外形不同，T24－9呈干細胞樣的細小圓球形（圖1）。

圖1 T24－9與T24細胞形態學差異（bar＝100μm）

2.3 細胞增殖活力定量比較

生長曲線顯示，除傳代第1天外，T24－9在第3、5和7天較T24具有更強的增殖活力（圖2）。

圖2 T24－9和T24生長曲線（n＝4）

2.4 基因轉錄水平比較

基因轉錄水平相對定量分析顯示，增殖相關基因CCND1在T24－9中較T24中顯著高表達。腫瘤干細胞標志物表達T24－9高于親代T24，但差異并不顯著。ARID1A的表達情況與CCND1類似，T24－9表達水平高于T24。

3 討論

ARID1A是染色質重建復合物SWI／SNF的一個亞基，能促進細胞的增殖，其缺失將嚴重干擾胚胎干細胞的正常發育［4］。從2010年發現ARID1A在子宮內膜異位相關卵巢癌中高達50%以上的突變以來［5，6］，ARID1A在腫瘤研究中受到極大關注。2011年發現膀胱移行細胞癌中ARID1A也有高達13%的突變［2］。雖然與細胞增殖有密切關聯，ARID1A在腫瘤發生和發展中的作用機制仍然未知。

圖3 T24－9和T24中CCND1、ARID1A和CD44轉錄水平比較（n＝3，P＜0.05）

本研究通過分離得到膀胱癌細胞系亞克隆T24－9，生長曲線顯示較親代T34細胞具有更強的增殖活力。CCND1表達的Cyclin D1蛋白是細胞G1／S期過渡的重要調控因子，促進細胞周期進行，其表達上調可以使細胞生長失控［7］。相對定量分析顯示，亞克隆T24－9比親代T24具有更高的CCND1表達量，進一步證實了T24中存在基因表達特點有差異的高增殖活力細胞亞群。

腫瘤干細胞理論認為，腫瘤細胞在成瘤能力上具有不均一性，只有少數高轉移潛能的腫瘤干細胞細胞亞群才有能力誘發并維持腫瘤惡性，只有征對腫瘤干細胞進行治療才有可能完全抑制腫瘤［8］。形態學顯示T24－9呈細小的圓球形快速生長。通過檢測膀胱癌腫瘤干細胞標志物CD44［9］，發現T24－9較T24的表達水平高，但差異不具有顯著性意義，可能是親代細胞系本身即具備了某種永生化特點，某些腫瘤干細胞標志物表達呈現陽性。結果表明，T24－9是一個具有腫瘤干細胞樣特點的細胞亞群。

ARID1A基因長達86kb，包含32個外顯子，cDNA長8kb，而且，ARID1A的在酵母中的正常轉錄量只有大約100個拷貝［3］，其功能研究受到其長度和表達量的雙重制約。我們測序發現T24膀胱癌細胞ARID1A正常表達，可以作為ARID1A功能研究一個目的細胞。分離高增殖活力的T24－9亞克隆，定量結果顯示T24－9中ARID1A表達量較親代細胞系有10倍以上的增加。作為一個促進細胞增殖的基因，ARID1A表達增加或許為細胞增殖所需要，而過度表達或許也是造成ARID1A突變的原因之一。高增殖活力的T24－9亞克隆細胞株的分離，為進一步研究ARID1A在膀胱癌發生和發展的相關作用提供了基礎。

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