吉林省雙陽梅花鹿鹿茸蛋白組分的細胞毒性實驗研究

吳 荻，魏征人，陳智嘉，劉玉俠，宋光子，高宇航，趙大瑋

（1.吉林省腫瘤醫院 腫瘤內科，吉林 長春130012；2.吉林大學白求恩醫學院 藥理學教研室，吉林 長春130021；3.吉林省腫瘤防治研究所，吉林 長春130012）

鹿茸（Cornu Cervi Pantotrichum）為梅花鹿（Cervus nippon）或馬鹿（cervus elaphus）的雄鹿末骨化密生絨毛的幼角，為我國名貴的傳統中藥材，鹿茸蛋白（pilose antler protein，PAP）是從鹿茸中提取的一類具多種生理活性的物質，占鹿茸總質量的52%以上［1－3］，近年來一系列相關的研究發現鹿茸蛋白具有免疫調節、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗疲勞、治療神經損傷等多種生物學效應［4，5］，有廣泛的應用前景和巨大的藥用價值［6］。為進一步研究鹿茸蛋白可能存在的抗腫瘤活性，本課題組特選人肝癌SMMC－7721細胞及人肺腺上皮SPC－A－1細胞進行細胞毒性實驗研究，為鹿茸蛋白的抗腫瘤應用及其作用機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與主要儀器 雙陽梅花鹿鹿茸購自吉林雙陽梅花鹿養殖基地；超濾離心管（Millipore公司，美國）；透析袋（北京華美生科生物技術有限公司）；SMMC－7721細胞、人肺腺上皮 SPC－A－1細胞（吉林省腫瘤防治研究所保存并提供）；測定蛋白濃度的Folin－酚試劑盒和刀豆蛋白A（Con A）（長春鼎國公司）；5－氟尿嘧啶（5－FU）和順鉑 （DDP）（云南個舊生物制藥有限公司，批號：101203）；其余試劑皆為國產分析純試劑；酶標儀 （Lab Systerm Dragon.Multiskan MK3）。

1.2 鹿茸蛋白組分的提取 稱取新鮮梅花鹿鹿茸900g，橫向切成厚度約為3mm圓形薄片，用超純水沖洗至無血色為止。加入0.01MPBS溶液1 500 ml，用高速組織勻漿機粉碎勻漿，再將勻漿液在4℃條件下，以8 000rpm／min離心15min，取上清液，用截留分子量8000的透析袋以超純水透析，每12h換一次透析液，36h后，將透析袋內液體取出，用截留分子量30 000和10 000的超濾離心管進行分子量截留，4℃條件下，以8 000rpm／min離心15min，離心后，分別取超濾膜兩側的液體，獲取3種不同分子量的鹿茸蛋白組分，0.22μm的微孔濾膜過濾除菌。然后用Folin－酚試劑法測蛋白濃度，用5倍倍比稀釋法構成5個相關濃度的稀釋液，保存在－70℃中待用。

1.3 鹿茸蛋白組分的細胞毒性實驗

1.3.1 細胞培養 SMMC－7721細胞及人肺腺上皮SPC－A－1細胞培養于IMDM培養基（10%胎牛血清，5%二氧化碳，37℃），常規復蘇后培養5天后，第一次傳代，以后每3天傳代一次，取長至對數生長期的細胞計數后種板，進行后續實驗。

1.3.2 MTT檢測 取對數生長期細胞消化，制備5×104／ml細胞懸液，接種于96孔板 ，每孔加細胞懸液180μl。培養24h后，進行實驗分組及加樣（不同分子量蛋白組分樣品按5倍濃度做倍比稀釋，各濃度做4復孔），用5－FU（25，50，100μg／ml）和DDP（10，20，40μg／ml）做陽性對照。然后進行孵育24h后的MTT檢測。每孔加20μl MTT，繼續培養4h。棄去上清液，加 DMSO 200μl／孔，震蕩器上震蕩使充分溶解。在酶標儀490nm波長處讀取A值，求出平均值，抑制率（IR）＝（1－實驗組A值／對照組A值）×100%。IR＜30%為不敏感，IR≥30%為低度敏感，IR≥50%為中度敏感，IR≥70%為高度敏感［8］。

1.4 鹿茸蛋白組分的淋巴細胞轉化實驗

將昆明小鼠分為：鹿茸蛋白高，中，低3濃度組（鹿茸蛋白原濃度的1／2，1／4，1／8）；胸腺肽陽性對照組（濃度1mg／ml）；生理鹽水陰性對照組；給藥劑量0.01ml／g。經皮下注射14天后，每組各取5只斷頸處死后，經75%乙醇消毒后，放置超凈臺中。

無菌取出脾臟，將其裹入2層無菌紗布中，放置35mm細胞培養皿中，用彎頭鑷子輕輕擠壓脾臟，將脾細胞游離出來。用2ml的RPMI1640培養基（含10%小牛血清）稀釋成脾細胞懸液。緩慢的滴入2ml淋巴細胞分離液的上方。2 000rpm 20 min，離心后，清晰可見細胞分層（共4層）。用吸管輕輕吸出乳白色層（第二層）。置入1.5ml無菌EP管中，2 000rpm，5min。棄去上清液，加入1ml的D－hanks液。2 000rpm，5min（洗3次），棄洗液，加入RPMI1640培養基（含10%小牛血清）。每組管取0.02ml加到細胞計數板上，并調至細胞終濃度約為2×106。將10%小牛血清的培養基（含ConA0.005mg／ml）加入96孔無菌細胞板中，每孔0.05ml，再加入脾細胞懸液0.05ml（每組設三個復孔），并設置培養基（不含脾細胞懸液）的空白對照孔。培養板置于CO2培養箱中（37°5%CO2）培養72h。

培養終止前2h。取出培養板，每孔依次加入MTT（5mg／ml）0.01ml。加完后輕輕搕板，使之與細胞充分混勻，繼續培養4h。棄去上清液，并加入DMSO 0.1ml。將顆粒溶解，并終止培養。通過酶標儀570nm檢測OD值。將實驗組和對照組的三復孔OD值平均，轉化值＝實驗組平均OD值－陰性對照組平均OD值。

1.3.3 統計學分析 數據采用統計軟件SPSS13.0處理。5－FU、順鉑及鹿茸多肽蛋白對于腫瘤細胞的抑制率數值比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 鹿茸各蛋白組分的濃度測定 根據標準曲線得公式y＝0.0082x＋0.3066，Folin－酚試劑盒測得各蛋白組分的濃度值如下：分子量＜10kD：A：0.347，蛋白濃度：4.93μg／ml；分子量＞10kD＜30 kD：A：0.335，蛋白濃度：3.46μg／ml；分子量＞30kD：A：0.483，蛋白濃度：21.51μg／ml。因蛋白濃度測前已稀釋20倍，故分子量＜10kD蛋白組分的原濃度為98.6μg／ml，倍比稀釋濃度由高到低依次為19.72μg／ml，3.94μg／ml，0.79μg／ml，0.16μg／ml。分子量＞10kD＜30kD蛋白組分的原濃度為69.20μg／ml，倍比稀釋濃度依次為13.84μg／ml，2.77μg／ml，0.55μg／ml，0.11μg／ml。分子量＞30 kD蛋白組分的原濃度為430.20μg／ml，倍比稀釋濃度依次為86.04μg／ml，17.21μg／ml，3.44μg／ml，0.69μg／ml。

2.2 鹿茸各蛋白組分的細胞毒性實驗結果 鹿茸各蛋白組分針對SPC－A－1細胞的 MTT實驗結果，經計算得出的細胞生長抑制率見表1。從表1中，SPC－A－1細胞對鹿茸各組分蛋白不敏感，呈現“耐藥”現象，和陽性對照組相比有明顯的差異（P＜0.05）。

表1 鹿茸各蛋白組分針對SPC－A－1的細胞生長抑制率（%）

鹿茸各蛋白組分針對SMMC－7221細胞的MTT實驗結果，經計算得出的細胞生長抑制率見表2。從表2中，分子量＜10kD，＞30kD，10～30 kD的鹿茸蛋白組分中，高劑量組的抑制率均大于30%，呈現“低度敏感”；分子量＜10kD，10～30kD的鹿茸蛋白組分中，中高劑量組的抑制率大于30%，呈現“低度敏感”。而且呈現劑量依賴性關系。

表2 鹿茸各蛋白組分針對SMMC－7221的細胞生長抑制率（%）

2.3 鹿茸蛋白組分的淋巴細胞轉化實驗結果 鹿茸蛋白組分高、中、低劑量組的平均OD值分別為為0.46±0.05、0.29±0.03和0.17±0.03；胸腺肽陽性對照組的平均OD值為0.47±0.07；生理鹽水陰性對照組的平均OD值為0.12±0.04。鹿茸蛋白組分高、中、低劑量組的轉化值分別為0.34、0.17和0.05；胸腺肽陽性對照組的轉化值為0.35。鹿茸蛋白組分的高中劑量組和胸腺肽對照組與陰性對照組OD值比較，差異具有顯著性（P＜0.05）；鹿茸蛋白組分的高劑量組和胸腺肽對照組OD值比較，差異不具有顯著性（P＞0.05）。

3 討論

吉林省長春市雙陽區有300多年養鹿歷史，此地區養殖的梅花鹿是我國特有的梅花鹿品種，而鹿茸蛋白具有促生長、抗氧化、提高免疫力、抗腫瘤等多種生物學活性。本實驗采用了超濾離心法是目前很流行的一種根據分子量不同的蛋白質組分分離方法［9］，其具有分離速度快，操作簡便，獲取的分子量范圍比較準確、不喪失蛋白活性、具有濃縮效應等諸多優點，便于今后鹿茸蛋白組分的分級分離中大規模應用。

本課題組曾就鹿茸蛋白應用安全性問題進行過初步的研究［10］，發現鹿茸總蛋白經過口服、皮下、腹腔注射等給藥途徑，對小鼠組織器官有一定的病理性損傷，但不知這種損傷是否和其細胞毒性有關。進一步實驗采用了MTT法，旨在探討鹿茸蛋白對于所選取的人肝癌SMMC－7721細胞系和人肺腺癌SPC－A－1細胞系是否有明確的細胞毒性作用，陽性對照是5－FU 及順鉑，［11，12］實驗結果顯示：SMMC－7721和SPC－A－1對5－FU 敏感性較高，SPC－A－1對鹿茸各組分蛋白不敏感，不同分子量的鹿茸蛋白組分組間比較，細胞毒性無統計學差別（P＞0.05）；而SMMC－7721細胞對順鉑及鹿茸蛋白低度敏感，說明鹿茸各分子量蛋白組分有輕微抑制SMMC－7721細胞生長的作用，與順鉑作用相似，而且抑制作用與濃度呈正相關，雖然這種細胞毒性與5－FU相比有明顯的差異（P＜0.05），但因其抑制率超過30%，說明了鹿茸蛋白組分具有輕度抑制腫瘤生長的作用。可進一步進行信號傳導通路方面的研究，明確其作用機制。

另外，本研究還探討了鹿茸蛋白組分促進淋巴細胞轉化增殖活性，研究結果顯示：鹿茸蛋白組分均具有明確的促進淋巴細胞轉化功能，其中，高劑量組與胸腺肽陽性對照組具有相似的促進淋巴細胞轉化活性，兩者沒有明顯的差異（P＞0.05）。提示鹿茸蛋白組分的抗腫瘤作用可能還有免疫學途徑的參與，值得進一步研究。

［1］佟 鑫，劉玉俠，吳 荻，等.鹿茸多肽組分藥理作用的研究進展［J］.中國醫藥技術經濟與管理，2009，3（4）：60.

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［3］鄢德俊，劉 霞，呂淑琴.鹿茸的化學成分與藥理作用的研究概述［J］.上海中醫藥雜志，2004，38（3）：63.

［4］桂麗萍，郭 萍，郭遠強.鹿茸化學成分和藥理活性研究進展［J］.藥物評價研究，2010，33（3）：237.

［5］劉琳玲，叢 波，姜洪梅.鹿茸多肽功能的研究進展［J］.特產研究，2009，31 （2）：67.

［6］趙滿倉，魏文青，劉 晶，等.MTT法抗腫瘤藥敏試驗影響因素的探討［J］.臨床腫瘤學雜志，2009，14（4）：306.

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［8］趙大瑋，李 丹，陳智嘉，等.吉林省雙陽梅花鹿鹿茸水溶性蛋白組分的提取及對小鼠主要臟器病理形態學的影響［J］.吉林大學學報（醫學版），2011，37（3）：448.

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［10］van Rijt SH，Sadler PJ.Current applications and future potential for bioinorganic chemistry in the development of anticancer drugs［J］.Drug discovery today，2009，14（23－24）：1089.