人孕中期羊水干細(xì)胞體外轉(zhuǎn)化為神經(jīng)細(xì)胞的實驗研究

李 歡，高 垚，王歡歡，常 穎＊

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)一科，吉林 長春130033；2.長春市中心醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長春130051）

羊水干細(xì)胞是近幾年來備受關(guān)注的一類具有多向分化潛能的組織干細(xì)胞，在體外不同的誘導(dǎo)條件下，可以向神經(jīng)細(xì)胞、肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等分化［1］。本實驗探討了在體外特定的誘導(dǎo)條件下，成人羊水干細(xì) 胞 （human amniotic fluid－derived stem cells，hFSCs）向神經(jīng)元細(xì)胞轉(zhuǎn)化的規(guī)律，為羊水干細(xì)胞應(yīng)用于臨床提供可靠的實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 AmnioMAX－Ⅱ培養(yǎng)基

α－MEM（Gibco公司）；胎牛血清、HEPES緩沖液、bFGF（Hyclo ne公司；胰蛋白酶、β－巰基乙醇（Sigma公司）；熒光素標(biāo)記小鼠抗人CD44、CD45抗體（eBioscience公司）；鼠抗人的 NSE、GFAP（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司）；倒置相差顯微鏡（Olympus）；YJ－2操凈臺 （蘇州凈化設(shè)備廠）；CO2孵箱（SANYO日本）

1.2 方法

1.2.1 hAFC的原代培養(yǎng) 羊水標(biāo)本來自懷孕16－22周行產(chǎn)前檢查或自愿引產(chǎn)的孕婦，在超聲引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺取得20ml羊水。取標(biāo)本前均征得孕婦本人同意，并得到醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。羊水標(biāo)本在室溫下1000／min離心5min，棄上清，加入AmnioMAX－Ⅱ培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱，出現(xiàn)梭形細(xì)胞為主、類成纖維細(xì)胞的細(xì)胞集落且達(dá)70%匯合后，0.25%胰蛋白酶1mmol·L－1EDTA消化后，改用α－MEM＋10%胎牛血清＋4 μg／LbFGF培養(yǎng)基，接種培養(yǎng)，記為第1代（P1）。細(xì)胞生長達(dá)到80%融合時按1∶4的比例傳代。

1.2.2 hAFC的傳代培養(yǎng) 原代培養(yǎng)一旦鋪滿整個培養(yǎng)板的底部，即可用0.25%胰蛋白酶1mmo l·L－1EDTA液消化、分離，然后按3×104／cm2密度傳代接種于6孔培養(yǎng)板中，并記為P1；傳代培養(yǎng)直至貼壁細(xì)胞彼此融合，鋪滿整個培養(yǎng)板的底面；再重復(fù)以上操作，并記為P2，以此類推，傳代培養(yǎng)直至細(xì)胞出現(xiàn)衰老征相。傳代培養(yǎng)的接種密度嚴(yán)格控制在與原代培養(yǎng)接種密度相同的水平以便于對照。

1.2.3 hAFC細(xì)胞表面分子測定 第10代細(xì)胞80%～90%融合后，用0.25%胰酶1mmol·L－1EDTA液消化細(xì)胞，制成2×105／mL的單細(xì)胞懸液，分別加入3個Eppendof管中。A管為標(biāo)準(zhǔn)對照，加入5μL IgG1－FITC的單克隆抗體；B管加入5μLCD44－FITC單克隆抗體；C管加入5μL CD45－FITC單克隆抗體，室溫反應(yīng)30min，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4 羊水細(xì)胞核型分析 取生長良好的細(xì)胞第10代、20代羊水干細(xì)胞進(jìn)行核型分析。細(xì)胞培養(yǎng)液中加入秋水仙素，培養(yǎng)4h后胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，然后固定、制片、Gimsa染色后鏡下觀察并分析結(jié)果。

1.2.5 實驗分兩組 實驗組及對照組，實驗組又分：NSE組、GFAP組和尼氏染色組，每組包括18個細(xì)胞爬片。將第10代的hFSCs按3×103／cm2接種于24孔培養(yǎng)板中（預(yù)先放置經(jīng)賴氨酸處理的蓋玻片。細(xì)胞80%～90% 融合后，棄去培養(yǎng)液，細(xì)胞用含20%FCS、10ng／ml bFGF的α－MEM 預(yù)誘導(dǎo)24h，更換培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，再加入含5 mmol／Lβ－巰基已醇的無血清α－MEM進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)5h，然后進(jìn)行尼氏體及免疫組織化學(xué)染色。實驗對照組用未誘導(dǎo)的hFSCs爬片直接進(jìn)行NSE、GFAP染色。誘導(dǎo)后的細(xì)胞染色后隨機(jī)取10個非重疊視野（×100），計算陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比例，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

2 結(jié)果

2.1 hAFC的分離、純化、擴(kuò)增 原代培養(yǎng)4d可見有細(xì)胞貼壁，平均7d左右散在的梭形細(xì)胞為主、類成纖維細(xì)胞的細(xì)胞集落。平均14天左右可達(dá)80%融合。傳代培養(yǎng)后，12h即可貼壁，細(xì)胞呈較均一的長梭形，7d左右細(xì)胞可鋪滿整個培養(yǎng)瓶底面，可繼續(xù)傳代擴(kuò)增。傳代后的細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，性質(zhì)穩(wěn)定。

2.2 hAFC表型 hFSC均一表達(dá)CD44，但CD45陰性。

2.3 第10代、20代羊水干細(xì)胞檢測干細(xì)胞核型正常，為46XX和46XY。

2.4 hFSC向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中細(xì)胞形態(tài)變化誘導(dǎo)30min，即發(fā)現(xiàn)原來大而扁平的hMFSCs胞體發(fā)生收縮；誘導(dǎo)2h后，細(xì)胞進(jìn)一步收縮，胞體由長梭形逐漸變成圓形或類圓形，立體感增強(qiáng)，有許多細(xì)的指狀突起（見圖1a）。5h后細(xì)胞形態(tài)基本不再發(fā)生變化，有80%以上的細(xì)胞呈典型的神經(jīng)元樣形態(tài)，多個神經(jīng)樣細(xì)胞的突起可相互延伸形成網(wǎng)狀（見圖1b）。6h以后，大部分細(xì)胞從培養(yǎng)板上脫落，死亡。對照組細(xì)胞仍然保持寬大扁平的狀態(tài)。

圖1a 誘導(dǎo)2h細(xì)胞形態(tài)的改變×200

圖1b 誘導(dǎo)5h細(xì)胞形態(tài)改變×200

2.5 尼氏染色 第10代hFSCs誘導(dǎo)2h后，神經(jīng)元細(xì)胞胞質(zhì)中未見深藍(lán)色的尼氏體；在誘導(dǎo)5h后的胞漿中均可見深藍(lán)色的顆粒狀尼氏體，未誘導(dǎo)的hFSCs胞漿中未見明顯的深藍(lán)色尼氏體結(jié)構(gòu)。

2.6 免疫組織化學(xué)染色 未誘導(dǎo)的hFSCs不表達(dá)NSE、GFAP。誘導(dǎo)5h后的細(xì)胞表達(dá)NSE，不表達(dá)GFAP（見圖2a）；NSE陽性細(xì)胞表現(xiàn)為彌漫性胞漿棕褐色著色（見圖2b），誘導(dǎo)5hNSE陽性細(xì)胞數(shù)為（79.8±1.9）%。

圖2 a 向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)5hNSE染色×200

圖2 b 向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)5hGFAP染色×200

3 討論

隨著組織工程的興起和發(fā)展，細(xì)胞替代治療將成為攻克一些疑難病癥的新途徑。目前，科學(xué)家們真在嘗試通過組織工程技術(shù)將組織干細(xì)胞體外擴(kuò)增和定向誘導(dǎo)為所需細(xì)胞，然后植入患者體內(nèi)，用以修復(fù)損傷、替代退行性組織以及改善遺傳性缺陷組織的功能。羊水干細(xì)胞最早是在2003年被Prusa［2］等發(fā)現(xiàn)；2007年，Paolo［3］等將由羊水中分離獲得的干細(xì)胞命名為羊水干細(xì)胞（AFC），這種細(xì)胞表達(dá)MSC（Mesenchymal stem cell）、不表達(dá)造血細(xì)胞系標(biāo)記，90%的細(xì)胞表達(dá)Oct－4；這一發(fā)現(xiàn)引發(fā)了羊水干細(xì)胞研究的熱潮，羊水干細(xì)胞有望成為新的干細(xì)胞種子來源，應(yīng)用于細(xì)胞及基因治療。

FSCs在羊水中的峰度并不高［4］，因此在體外條件下進(jìn)行分離、純化并實行體外擴(kuò)增就顯得尤為重要。本實驗采用羊水專用培養(yǎng)基（美國Hyclone公司AminioMAX－Ⅱcomplete培養(yǎng)基），結(jié)合機(jī)械分離方法從羊水中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞，并成功的在體外擴(kuò)增。雖然目前國內(nèi)外的科學(xué)家都致力于羊水干細(xì)胞的研究，但尚未發(fā)現(xiàn)AFC特征性的表面標(biāo)記。AFC在細(xì)胞表型上類似于胚胎干細(xì)胞和成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，即SH2、CD44和CD90陽性，CD34、CD45 和 CD117HLADR 陰 性［5］；在 AFSC表面標(biāo)記中引人注意的是POU轉(zhuǎn)錄因子4（Oct－4）等胚胎特異性標(biāo)記的表達(dá)［6］，提示羊水中存在比間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)育更原始、增殖和分化能力更強(qiáng)、更接近于胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞。本實驗流式細(xì)胞儀檢測其表達(dá)MSC細(xì)胞表面標(biāo)記CD44，不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記CD45，因此證明我們培養(yǎng)的羊水細(xì)胞是具有MSC特性的干細(xì)胞。

本實驗依據(jù) Tsai［7］和Paolo［8］及王晗［9］的方法，取擴(kuò)增第10代的hMFSC，先用含細(xì)胞用含20%FCS、10ng／ml bFGF的α－MEM 預(yù)誘導(dǎo)24h，更換培養(yǎng)液，再用含5mmol／Lβ－巰基乙醇的無血清DMEM培養(yǎng)液向神經(jīng)細(xì)胞方向進(jìn)行誘導(dǎo)，結(jié)果顯示誘導(dǎo)5h后的hMFSCs均一表達(dá)NSE，胞質(zhì)中可見深藍(lán)色的神經(jīng)元細(xì)胞特有的尼氏體結(jié)構(gòu)。

NSE和GFAP均為一種胞漿蛋白，NSE主要表達(dá)于神經(jīng)元；GFAP主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞。本實驗hFSCs誘導(dǎo)后，免疫組織化學(xué)鑒定結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后的細(xì)胞均表達(dá)NSE，而不表達(dá)GFAP。組織化學(xué)實驗結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后的細(xì)胞具有神經(jīng)元的特有結(jié)構(gòu)尼氏體形成。說明BME的誘導(dǎo)具有定向性，主要是向神經(jīng)元細(xì)胞分化，而不是向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化。

體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞目前主要有兩種方法，抗氧化劑［10］和生長因子誘導(dǎo)［11］，抗氧化劑快速、分化率較高，但細(xì)胞不能長期存活；生長因子誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后的細(xì)胞存活時間較長，但分化率較低。BME作為一種強(qiáng)的抗氧化劑，它的這種定向誘導(dǎo)作用可能與其能將細(xì)胞從氧化狀態(tài)中釋放出來有關(guān)，但具體的作用機(jī)理還不十分清楚；而且做為強(qiáng)氧化劑，BME對細(xì)胞有一定的毒性，因此在體外誘導(dǎo)實驗中，細(xì)胞在BME誘導(dǎo)液中不能長期存活，在6h后，大部分細(xì)胞從培養(yǎng)板中脫落下來，死亡。一些實驗表明：在一定的神經(jīng)生長因子存在的情況下，hFSCs可以向多巴胺能神經(jīng)元定向分化5。這表明，hFSCs向不同的方向分化需要不同的環(huán)境條件，細(xì)胞的定向分化性是受周圍環(huán)境因素影響和決定的，因此對這些分化機(jī)理的深入研究，將最終使我們更廣泛地應(yīng)用組織工程進(jìn)行細(xì)胞替代治療。

從實驗中我們可以看到，hFSCs在BME誘導(dǎo)下，可定向分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，細(xì)胞表達(dá)NSE，但誘導(dǎo)后的細(xì)胞不能長期存活，體外存活時間短；但文獻(xiàn)報道的采用神經(jīng)營養(yǎng)因子作為誘導(dǎo)劑的實驗中，雖誘導(dǎo)后的類神經(jīng)元細(xì)胞可存活時間較長，但誘導(dǎo)分化的陽性率較低。hMFSCs作為細(xì)胞替代治療的種子細(xì)胞，如何找到誘導(dǎo)后既能長期存活，又能有較高誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化率的適宜體外誘導(dǎo)條件，是值得我們進(jìn)一步研究、探索的問題。

［1］Coppi PD，Bartsch G，Siddiqui MM，et al.Isolation of amniotic stem cell lines with potential for therapy［J］.Nat Biotech，2007，25（1）：100.

［2］Prusa AR，Marton E，Rosner M，et al.Oct－4expressing cells in human amniotic fluid：a new source for stem cell research［J］？Hum Reprud，2003，18（7）：1489.

［3］Paolo DC，Georg B，Minhaj S，Tao X，et al.Isolation of amniotic stem cell lines with potential for therapy［J］.Nature Biotechnology，2007，25（1）：100.

［4］Kolambkar YM，Peister A，Soker S，et al.Chondrogenic differentiation of amniotic fluid－derived stem cells［J］.J Mol Histol，2007，38（5）：405.

［5］Sartore S，Maddalena L，Annalisa A，et al.Amniotic mesenchymal cells autotransplanted in a porcine model of cardiac ischemia do not differentiate to cardiogenic phenotypes［J］.Europ J Card Surg 2005，28：677.

［6］Bossolasco P，Montemurro T，Cova L.et al.Molecular and phenotypic characterization of human amniotic fluid cells and their differentiation potential［J］.Cell Res，2006，16（4）：329.

［7］Tsai MS，Hwang SM，Tsai YL，et al.Clonal amniotic fl uid－derived stem cells express characteristics of both mesenchymal and neural stem cells［J］.Biol Reprod，2006，74：545.

［8］Paola DG，Cristina L，Matteo B，et al.A real－time PCR approach to evaluate adipogenic potential of amniotic fluid－derived human mesenchymal stem cells［J］.Stem Cells Dev，2006，15（5）：719.

［9］王 晗.人源羊水干細(xì)胞分離、培養(yǎng)、生物學(xué)特性檢測機(jī)誘導(dǎo)分化的研究（博士論文），2008.

［10］Woodbury D，Schwarz EJ，Prockop DJ，Black IB.Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons［J］.J Neurosci Res，2000，61：364.

［11］Sanchez－Ramos J，Song S，Cardozo－Pelaez F，Hazzi C，Stedeford T，Willing A，F(xiàn)reeman TB，Saporta S，Janssen W，Patel N，Cooper DR，Sanberg PR.Adult bone marrow stromal cells differentiate into neural cells in vitro［J］.Exp Neurol，2000，164：247.