Rh（D）陰性孕婦血液中胎兒微量Rh（D）紅細(xì)胞與新生兒溶血病發(fā)病率的相關(guān)性研究

周 英，李 健，呂文彬，陳 雪，王乃紅，迭 敏

（成都市血液中心，四川 成都610041）

Rh血型在臨床輸血中具有重要意義，也是人類紅細(xì)胞血型系統(tǒng)中最為復(fù)雜、最具多態(tài)性的系統(tǒng)，其中RhD抗原因其能引起溶血性輸血反應(yīng)及新生兒溶血病而倍受重視［1］。新生兒溶血病（HDN）是由于母嬰血型不合，母體血中存在與胎兒血型抗原相應(yīng)的免疫性抗體（IgG型），此種特異性抗體可通過胎盤進(jìn)人胎兒，引起胎兒紅細(xì)胞破壞而發(fā)生溶血，并伴隨一系列病理損害，如黃疽，貧血，肝脾腫大等癥狀［2］。在我國，ABO血型不合導(dǎo)致新生兒溶血較多見，病情較輕；Rh（D）血型不合導(dǎo)致新生兒溶血較少見，但病情較重，具有黃疸出現(xiàn)早，發(fā)展迅速，病情危重等特點(diǎn)，易致死與致殘，它的治療的關(guān)鍵在于早發(fā)現(xiàn)，早預(yù)防，早治療［3］。因此，較早對(duì) Rh（D）陰性孕婦進(jìn)行胎兒是否發(fā)生Rh（D）血型不合導(dǎo)致新生兒溶血的評(píng)估顯得尤為重要。目前預(yù)防、診斷Rh（D）血型不合導(dǎo)致新生兒溶血病的基礎(chǔ)是檢測(cè)胎－母出血量［4］，采用血清學(xué)方法定性檢測(cè)母體是否被胎兒紅細(xì)胞致敏。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，流式細(xì)胞術(shù)能對(duì)血液中微量細(xì)胞群進(jìn)行定性及定量的分析，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等特點(diǎn)；有資料顯示，通過流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)胎兒紅細(xì)胞的數(shù)量，此方法靈敏度可達(dá)0.001%，是目前檢測(cè)胎兒紅細(xì)胞的最佳方法［5］。本研究采用相關(guān)文獻(xiàn)［1］中建立的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Rh（D）血型不合導(dǎo)致新生兒溶血病，探討其在產(chǎn)前診斷中的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

經(jīng)Rh（D）抗原初篩實(shí)驗(yàn)為陰性的醫(yī)院送檢孕婦標(biāo)本30例，妊娠周期為20～38周，年齡為18～35周歲，其中27例在孕期大于32周后追蹤檢測(cè)2次。

1.2 試劑與儀器

抗－D（IgG）單克隆抗體（上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司，效價(jià)1：32，批號(hào)20070119），RhD（IgM＋I(xiàn)gG）單克隆抗體（Biotest，德國，批號(hào)1110906），抗－D（IgM＋I(xiàn)gG）單克隆抗體（Dominion公司，加拿大，批號(hào) NDMG04203），抗－D（IgM＋I(xiàn)gG）單克隆抗體（Celliance公司，英國，批號(hào)BMJ0506G），廣譜抗人球蛋白試劑（上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司，批號(hào)20061221），F(xiàn)ITC－抗人IgG（γ），F(xiàn)（ab’）2純化抗體（KPL公司，美國，批號(hào)2021002），EPICS XL流式細(xì)胞儀（COULTER，美國），CX41顯微鏡（OLYMPUS），三用電熱恒溫水溫箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）。

1.3 方法

1.3.1 Rh表型血清學(xué)鑒定 RhD初篩及陽性判定按照《中國輸血技術(shù)操作規(guī)程》操作，RhD初篩陰性者的紅細(xì)胞分別與4種不同廠家和批號(hào)的單克隆抗－D做間接抗人球蛋白試驗(yàn)（IAT），設(shè)陰性及陽性對(duì)照。與4批抗－D反應(yīng)全部無凝集者判定為RhD陰性。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)用紅細(xì)胞的制備 取待檢孕婦紅細(xì)胞500μl，磷酸鹽緩沖液（PBS，PH7.4）洗滌3遍，配成細(xì)胞懸液，顯微鏡計(jì)數(shù)紅細(xì)胞的濃度，調(diào)細(xì)胞濃度為1×106／μl。同時(shí)設(shè)RhD陽性對(duì)照和陰性對(duì)照管。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)分析 待檢孕婦紅細(xì)胞懸液（細(xì)胞濃度為1×106／μl）50μl，加人源單克隆IgG 抗－D（批號(hào)20070119）50μl混勻，37℃孵育30min，PBS洗滌3遍，加 FITC－抗人IgG（γ），F(xiàn)（ab’）2純化抗體15μl（濃度為3μg／15μl），室溫避光反應(yīng)30min，PBS洗滌3遍，細(xì)胞以500uLPBS重懸，上機(jī)檢測(cè)。根據(jù)前向角散射（FSC）與側(cè)向角散射（SSC），設(shè)定“門”，使紅細(xì)胞與血小板、細(xì)胞碎片區(qū)別開來。收集50000個(gè)細(xì)胞，記錄光散射及熒光數(shù)據(jù)。每次測(cè)定前以Flowcheck調(diào)整儀器的光路和流路。

1.3.4 確定陰性閾值 取5份RhD陰性標(biāo)本（經(jīng)查證為未孕女性）作為陰性對(duì)照細(xì)胞，處理方法如上所示。對(duì)其紅細(xì)胞懸液進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，以陽性反應(yīng)細(xì)胞百分?jǐn)?shù)均值（±2s）設(shè)定陰性閾值。

1.3.5 患兒標(biāo)本血清學(xué)檢測(cè)HDN 在30例陰性孕婦產(chǎn)后，取患兒血液標(biāo)本，采用血清學(xué)方法進(jìn)行紅細(xì)胞直接抗人球蛋白試驗(yàn)、抗體篩選或抗體鑒定試驗(yàn)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果判定患兒是否為HDN（患兒Rh血型均為陽性）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS12.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 血型血清學(xué)結(jié)果

經(jīng)Rh（D）抗原確認(rèn)試驗(yàn)，陰性孕婦標(biāo)本為30例。

2.2 Rh（D）陰性孕婦血液中胎兒微量Rh（D）紅細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)與患兒標(biāo)本血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果比較，見表1。

表1 Rh（D）陰性孕婦血液中胎兒微量Rh（D）紅細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)與患兒標(biāo)本血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果比較

2.3 追蹤檢測(cè)兩次27例Rh（D）陰性孕婦血液中胎兒微量Rh（D）紅細(xì)胞比例，見表2。

表2 追蹤檢測(cè)兩次27例Rh（D）陰性孕婦血液中胎兒微量Rh（D）紅細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)值比較

3 討論

Rh血型系統(tǒng)是人類血型中最具多態(tài)性和免疫遺傳特性的一個(gè)系統(tǒng)，迄今已發(fā)現(xiàn)含有49個(gè)獨(dú)立的抗原，是輸血醫(yī)學(xué)中除ABO血型之外最具臨床意義的一個(gè)血型系統(tǒng)。RhD抗原的高免疫原性常常會(huì)引起胎兒和新生兒溶血病（HDN）、溶血性輸血反應(yīng)和自身免疫性溶血性貧血等疾?。?，7］。HDN是臨床常見的因母嬰血型不合導(dǎo)致新生兒溶血病，可以引起高膽紅素血癥、貧血等。雖然Rh（D）血型不合導(dǎo)致新生兒溶血病發(fā)生的機(jī)率較少，但其后果嚴(yán)重，孕期易導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎，新生兒極易發(fā)生黃疸、水腫、貧血、肝脾腫大及膽紅素腦病，甚至死亡。在產(chǎn)前對(duì)Rh（D）陰性孕婦進(jìn)行有效地評(píng)估顯得尤為重要。

本次研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)30例Rh（D）陰性孕婦血液中胎兒微量Rh（D）紅細(xì)胞；在孕婦產(chǎn)后取患兒血液標(biāo)本，采用血清學(xué)方法進(jìn)行新生兒溶血病的檢測(cè)。兩組數(shù)據(jù)由表1可以看出，Rh（D）血型不合，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)與血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果比較差異不顯著。有文獻(xiàn)報(bào)道［8］，Rh血型不合 HDN，由于RH抗原位點(diǎn)多且抗原決定簇在細(xì)胞外暴露多，比較容易被檢出，因此流式法和試管法的檢測(cè)陽性率均為100%。此次研究結(jié)果與報(bào)道基本相符。

胎兒細(xì)胞在母體內(nèi)具有一定的消長(zhǎng)規(guī)律。利用檢測(cè)母親外周血胎兒紅細(xì)胞進(jìn)行非創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷的最佳時(shí)間一直存在爭(zhēng)議。但目前普遍認(rèn)為，理想時(shí)間為早期和中期妊娠［9］。Sonda等［10］利用 CD71和GPA雙抗體經(jīng)FACS技術(shù)證實(shí)NRBC的濃度在孕7～l8周最高。我們對(duì)孕婦體內(nèi)胎兒微量Rh（D）紅細(xì)胞所占比例進(jìn)行了追蹤檢測(cè)，由表2可以看出追蹤檢測(cè)兩次的數(shù)據(jù)比較差異不顯著。本次研究由于條件限制，僅對(duì)孕婦進(jìn)行了2次追蹤檢測(cè)，在今后的研究中還可以進(jìn)行更詳細(xì)的追蹤檢測(cè)，有待進(jìn)一步探討。

本次研究的數(shù)據(jù)顯示，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)妊娠24周左右的Rh（D）陰性孕婦血液中胎兒微量Rh（D）紅細(xì)胞的方法，能較早預(yù)測(cè)新生兒溶血病發(fā)生的可能性，在一定程度上有助于新生兒溶血病的早期預(yù)防、治療、診斷，為抗D引起新生兒溶血病患兒的換血治療贏得了寶貴時(shí)間，減少了出現(xiàn)嚴(yán)重后遺癥的可能性。本研究具有靈敏度較高、實(shí)驗(yàn)結(jié)果易于判定、實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度和重復(fù)性較好等優(yōu)點(diǎn)，在臨床上有較大的運(yùn)用價(jià)值。建議Rh（D）陰性孕婦在24周左右常規(guī)做流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，為Rh（D）血型不合導(dǎo)致新生兒溶血病提供了一種早期預(yù)防﹑診斷的可靠依據(jù)，具有一定的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

［1］周 英，陳 雪，李健等.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)RhD（－）血液中微量D（＋）紅細(xì)胞的研究［J］.中國輸血雜志，2008，21（5）：346－348.

［2］萬艷紅.“O”型孕婦產(chǎn)前免疫學(xué)檢測(cè)對(duì)判斷新生兒溶血病價(jià)值的探討［J］.中國實(shí)用醫(yī)藥，2007，2（2）：47.

［3］楊江存，韓梅寧，張獻(xiàn)清.Rh血交換治療32例新生兒溶血病分析［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，26（24）：2280.

［4］Moise KJ.Red blood cell alloimmunization in pregnancy［J］.Semin Hematol.2005，42（3）：169.

［5］王建中，臨床流式細(xì)胞分析［M］.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2005.372.

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［7］Urbaniak SJ.Alloimmunity to RhD in humans［J］.Transfus clin Biol.2006，13（1－2）：19.

［8］戎 霞，羅廣平，付涌水，等.流式細(xì)胞術(shù)在母嬰血型不合新生兒溶血病檢測(cè)中的應(yīng)用［J］.熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2008，8（8）：791－793.

［9］陳漢平，沈 怡，張漢鳳等.運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)分析孕婦外周血中胎兒有核紅細(xì)胞的比例與孕周的關(guān)系［J］.實(shí)用婦產(chǎn)科雜志，2002，3（18）：104.

［10］Sonda Sa1cshi.Arinam T Hanada H，et al.The proportion of fetal Nucleared red blood cells in maternal blood：estimation by FACS Analysis Prenat Diagn［J］.Blood，1997，17：743.