綿羊腸毒血癥苗的研制及預防試驗

張西云，范玉霞，胡國元，李生慶，李秀萍

（青海省畜牧獸醫科學院，青海 西寧810016）

青海省海北州祁連縣默勒鎮2006～2008年綿羊發生持續死亡，死亡數達6 554只，發病前，該地區每年3～4月用羊三聯苗免疫羊群，但仍然有大量羊只發生死亡，經我室確診為腸毒血癥后，采用產氣莢膜梭菌標準菌株C60－2（D型），采用優化的培養基配方使該菌的產毒能力提高到3萬MLD／mL，制成羊腸毒血癥菌苗后2009年、2010年在青海祁連默勒地區免疫綿羊105 000只，結果免疫羊群均未發生本病。為該地區羊腸毒血癥的發生和流行提供了有效的菌苗，很大程度上減少了牧民的經濟損失。

1 材料

標準的產氣莢膜梭菌C60－2菌株（來自中國獸醫藥品檢查所）；VF培養基（本室自制）；健康家兔1.5～2kg購自樂都種兔場；16～20g小鼠購自地方病研究所；甲醛；氫氧化鋁膠（本室自制）。

2 方法

2.1 基礎液制備 將產氣莢膜梭菌標準菌株C60－2（D型）接種到加生肝的V.F培養基中，37℃培養24h，用16～20g小鼠測定毒力。

將培養24h的種子培養物接種至1萬mL的大瓶中，37℃培養24h。

2.2 最小致死量測定 吸取大瓶24h培養物1mL，加含2.5g／L胰酶的1%碳酸鈉溶液1mL，37℃活化45min，5 000r／min離心15min，上清用生理鹽水10倍遞減稀釋，每一稀釋度靜脈注射小鼠2只（0.2mL／只）。觀察記錄結果。

2.3 脫毒 按菌液量的1%加入甲醛后密封，37℃～38℃殺菌脫毒14d，每d充分振蕩2次。將脫毒后的樣品接種至加生肝的厭氣肝湯、普通肉湯、普通斜面上［1］，37℃培養7d觀察記錄。

2.4 安全檢驗 將脫毒后的樣品經胰酶活化離心，上清靜脈注射體重16～20g小鼠2只，每只0.4 mL，觀察記錄結果。結果：基礎液最小致死量為3萬MLD／mL；無菌檢驗，加生肝的厭氣肝湯、普通肉湯及普通斜面培養基上均無菌生長；脫毒的樣品經胰酶活化離心，上清注射的小鼠健活，脫毒完全。

2.5 制苗 經滅活、脫毒檢驗合格的基礎液，用銅紗濾過，用于配苗。先將檢驗合格的D型產氣莢膜梭菌的脫毒基礎液按基礎液4份加鋁膠1份的比例，加入滅菌的氫氧化鋁膠，再按全部容量的0.01%加入硫柳汞充分混合。

制苗完成后，取樣做無菌檢查，經無菌檢驗合格后，充分混合，定量分裝。

2.6 菌苗檢驗 本品靜置后，上層為黃褐色澄明液體，下層為灰白色的沉淀，振搖后呈均勻混懸液。

無菌檢驗：將菌苗接種至生肝的厭氣肝湯、普通肉湯、普通斜面培養基，37℃培養7d均無菌生長。

安全檢驗：用體重1.5～2kg家兔4只，各肌肉注射菌苗5mL，觀察14d。未見明顯不良反應，注射部位有蠶豆大硬結。

效力檢驗：取1.5～2kg家兔20只，隨機分成4組，免疫組15只，均為皮下注射；對照組5只。飼養至18d，靜脈攻毒，觀察菌苗保護情況。結果見表1。

表1 菌苗保護情況

2.7 苗的現地使用 2009年6月初在祁連默勒地區用該苗進行小群免疫試驗，免疫羊只20只，觀察21d，未見不良反應，2009年7月初及2010年7月初在該地區分別免疫羊只6.5萬只和4萬只，疫苗用時搖勻，不論羊只年齡大小，肌肉或皮下注射2mL。2009年及2010年免疫羊只均未發生羊腸毒血癥病。

3 結果與討論

通過菌苗的安檢、效檢及現地使用，證明該苗安全有效，是預防綿羊腸毒血癥的可靠菌苗。為解決祁連默勒地區使用羊三聯苗后仍發生羊腸毒血癥的現狀提供了保障。