7株雞源腸球菌的分離、鑒定及益生性能比較

惠 明 李莉媛， 張曉琳 韓 偉 郭偉群

7株雞源腸球菌的分離、鑒定及益生性能比較

惠 明1李莉媛1，2張曉琳2韓 偉2郭偉群2

(河南工業大學生物工程學院1，鄭州 450000)
(國家糧食局科學研究院2，北京 100037)

對從健康6日齡AA肉仔雞腸道中分離出的7株腸球菌進行了體外生物學特性研究。利用腸球菌選擇性培養基進行分離，采用16SrRNA和Biolog兩種方法進行菌種鑒定，并測定其生長、產乳酸、抑制病原菌、耐人工胃腸液等益生性能指標。研究發現，從小雞腸道中分離得到的7株菌，經鑒定為糞腸球菌(Enterococcus faecalis)或屎腸球菌(Enterococcus faecium)，通過對7株菌的益生性能進行綜合評價比較后，篩得菌株Enterococcus faecium GJ01013，其具有生長速度快(代時 ＜30 min)、延滯期短、產L－ 乳酸能力強(達6．5 g/L)、對致病型大腸桿菌K88/K99、多殺性巴氏桿菌、雞白痢沙門氏菌及金黃色葡萄球菌有較強的抑制作用(最大抑菌圈直徑可達21．5 mm)、人工胃腸液中存活率高(最高達93．5%)等優良特點，為飼用益生菌產品開發提供了菌種來源。

益生菌腸球菌 鑒定 體外評價

益生菌制劑作為飼用抗生素替代產品之一，越來越受到人們的重視。例如，益生菌能夠調節動物消化道的微生態區系平衡，通過補給優勢菌株，在動物腸道幫助建立和維持正常的腸道優勢種群，可有效排除或控制潛在的病原菌;促進動物生長，能夠合成維生素K、B族維生素、β－胡蘿卜素等可被動物直接吸收利用，從而加強動物的營養代謝;可產生非特異性免疫調節因子，產生干擾素，或作為免疫復活劑，刺激胃腸非特異性局部免疫，從而提高免疫球蛋白濃度和巨噬細胞的活性，增強機體免疫功能和抗病力等［1－4］。

腸球菌為消化道內正常存在的一類微生物，在腸黏膜具有較強的耐受和定植能力，并且是一種兼性厭氧的乳酸菌，與厭氧、培養保存條件苛刻的雙歧桿菌相比，更適合于生產和應用［5］。1989年美國FDA就公布它為可直接用于動物的菌種之一。我國農業部第1126號公告公布允許使用的飼料添加劑品種目錄(2008)中，微生物飼料添加劑有16種，屎腸球菌(Enterococcus faecium)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)和乳酸腸球菌(Lactococcus lactis)也都包括在內［6］。一般認為，優良的益生菌菌株應來自動物體內，能夠耐受胃腸道內環境、生長快、能產乳酸、抑制病原菌生長及能夠在腸道內定植等［7］。本試驗從6日齡健康AA肉仔雞腸道中分離出7株腸球菌，從益生學角度出發評價其體外生物學性能，最后篩選出綜合性能較好的一株菌，為開發飼用益生菌產品提供菌株來源。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

1．1．1 試驗菌種

大腸桿菌K88(Escherichia coli K88)、大腸桿菌K99(Escherichia coli K99)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)、雞白痢沙門氏菌(Salmonella pullorum)和金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach):中國獸醫菌種保藏管理中心(CVCC);對照菌糞腸球菌CGMCC1．0130:中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。

1．1．2 主要儀器

HVE－50高壓蒸汽滅菌鍋:日本Hirayama公司;YS100雙目生物顯微鏡:日本Nikon公司;Microstation自動微生物鑒定儀:美國Biolog公司;SWCJX－2F凈化工作室:蘇州匯通空調凈化工程有限公司;SBA－40C生物傳感儀:山東省科學院生物研究所;Mastercycler普通PCR儀:德國艾本德股份公司;DYY－6C電泳儀:北京市六一儀器廠。

1．1．3 培養基配方

腸球菌選擇性培養基(EC):蛋白胨2 g，酵母浸膏0．5 g，葡萄糖0．2 g，Na2HPO40．4 g，K2HPO40．4 g，瓊脂2 g，雙蒸水100 mL，pH 7．4，冷至45～50℃，加入NaN3至終濃度為0．4 mg/mL，2，3，5－氯化三苯四氮唑(TTC)至0．1 mg/mL。

MRS液體培養基:蛋白胨10 g，牛肉浸膏10 g，酵母浸膏5 g，K2HPO42 g，檸檬酸氫二銨2 g，葡萄糖20 g，乙酸鈉5 g，Tween－80 1 mL，MgSO4·7H2O 0．58 g，MnSO4·H2O 0．25 g，1 000 mL蒸餾水，用1 mol/L NaOH調節至pH 7．0，115℃滅菌30 min。MRS固體培養基是在液體培養基的基礎上加入1．5%的瓊脂。

LB液體培養基:胰蛋白胨10 g，酵母浸膏5 g，NaCl 10 g，1 000 mL蒸餾水，用5 mol/L NaOH調節至pH 7．0，121℃滅菌20 min。LB固體培養基是在液體培養基的基礎上加入1．5%的瓊脂。

1．2 試驗方法

1．2．1 腸球菌的分離［8］

采集健康6日齡AA肉仔雞空腸、回腸、盲腸腸道內容物，用滅菌的載玻片刮取黏液，用滅菌生理鹽水稀釋到10－4，取0．1 mL涂布于腸球菌選擇性培養基(EC)平板上，37℃厭氧培養24 h，挑取有藍黑色環帶，表面光滑凸起，周邊整齊，直徑1．0～1．5 mm的菌落，轉接于EC基礎斜面，涂片，革蘭氏染色鏡檢，篩選G+，呈圓形或卵圓形，單個、成對或短鏈狀排列的菌株，20%甘油保種，－20℃冰箱保存備用。

1．2．2 Biolog菌種鑒定

按照Biolog GP2微生物鑒定儀使用手冊和Biolog微生物自動分析系統－細菌鑒定操作規程的研究所述的操作步驟進行Biolog菌種鑒定［9－10］。

1．2．3 16SrRNA鑒定

1．2．3．1 總DNA的提取

用Progema Wizard Genomic DNA提取試劑盒提取菌株總DNA。

1．2．3．2 PCR擴增及測序［11］

正向引物:5'－GAGTTTGAT CCT GGC TCAGGA CGA－3'，反 向 引物:5'－CGC ACC TTC CGATAC GGG CTA CCT－3'由上海英駿生物技術有限公司合成。反應體系:正向引物(24 bp)1μL，反向引物(24 bp)1μL，10×Buffer 5μL，Mg2+4μL，dNTP 2μL，Ex-Taq酶1μL，模板3μL，ddH2O 35μL。反應程序:預變性95℃，5 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸50 s，30個循環;72℃延伸5 min。取10μL擴增產物加入2μL溴酚藍染色液，混勻加在1%瓊脂糖凝膠(含goldview 2．5μL)，1×TAE緩沖液中恒壓80 V電泳45 min，用凝膠成像儀觀察結果。將PCR反應產物直接送至上海英駿生物技術有限公司進行測序。

1．2．4 生長曲線與乳酸代謝曲線的測定［12］

將甘油低溫保存的各菌株按1%接入到MRS液體培養基中培養8 h作為種子。將1 mL種子液分別加入100 mL的MRS培養基中，在37℃，150 r/min培養18 h，每2 h取樣一次，以MRS液為對照，對所取樣品分別測定OD600，每個處理3個重復，記錄數據繪制生長曲線。同時使用生物傳感儀分別測定各時間點菌體培養液中乳酸產量，重復3次，記錄數據繪制乳酸代謝曲線。

1．2．5 抑菌活性的測定

采用牛津杯法測定各菌株對致病型大腸桿菌K88/K99、多殺性巴氏桿菌、雞白痢沙門氏菌及金黃色葡萄球菌的抑制能力［13］。

1．2．6 人工胃、腸液耐受性測定

人工胃液配方:取100 g/L的鹽酸16．4 mL加蒸餾水稀釋，使pH值分別為1．5、2．5和3．5，然后按照每100 mL加1 g的量加入胃蛋白酶，充分溶解，微孔濾膜(0．22μm)除菌，待用［14］。

人工腸液配方:取KH2PO46．8 g，加蒸餾水500 mL溶解，用質量分數4 g/L NaOH溶液調至pH 6．8，加水稀釋至1 000 mL，按照每100 mL加1 g的量加入胃蛋白酶，充分溶解，微孔濾膜除菌(0．22μm)，待用［15］。

將活化后的菌株分別以10%接種量接入上述人工胃、腸液中，每個處理設3個重復，37℃恒溫培養1．5 h，利用平板菌落計數法測定菌數并計算存活率。

1．2．7 數據處理

使用Origin8．0制圖，SPSS16．0進行數據分析處理。

2 結果與分析

2．1 菌株鑒定

2．1．1 形態觀察

經菌落形態和顯微形態觀察，分離的7株菌均符合腸球菌的形態特征。在腸球菌選擇性培養基上菌落周圍有藍黑色環帶，表面光滑凸起，周邊整齊，單菌落直徑1．0～2．0 mm，革蘭氏染色為G+，圓形或卵圓形，成對或短鏈狀排列，分別編號為:GJ01007、GJ01010、GJ01011、GJ01012、GJ01013、GJ01014和GJ01015。圖1為GJ01013的菌落形態及顯微形態圖。

圖1 GJ01013菌落形態及顯微形態

2．1．2 Biolog鑒定結果

Biolog微生物自動分析系統主要根據細菌對糖、醇、酸、酯、胺和大分子聚合物等95種碳源的利用情況進行鑒定［16］。7株菌鑒定結果均為種名，如表1所示。

表1 Biolog系統鑒定結果

2．1．3 16SrRNA鑒定結果

16SrRNA基因含有高度保守的基因片段，大約1．5 Kb，由圖2可以看出，7株菌在1 000～2 000 bp間均有明顯的條帶，1．5 kb左右，這表明PCR反應擴增出了預期長度的16S rDNA序列。將測序得到的結果應用BLAST程序在GenBank數據庫中進行相似性比較，得出GJ01007、GJ01010、GJ01011、GJ01012和GJ01015與糞腸球菌(Enterococcus faecalis)的同源性為99%，GJ01013和GJ01014與屎腸球菌(Enterococcus faecium)的同源性為100%。

圖2 16SrDNA基因PCR反應產物凝膠電泳結果

2．2 菌株的生長、產乳酸性能

腸球菌生長速度快、代時短和產乳酸能力強是其作為益生菌制劑的一個很大優勢。如圖3、圖4所示，7株菌在1～2 h就進入了對數增長期，并持續到8 h，之后進入穩定期。隨著菌體的生長，乳酸產量也逐漸升高，在14 h后基本趨于穩定。通過與對照菌株Ef1．0130和其他菌株相比較，GJ01013代時＜30 min、延滯期短、最大生長比速率為0．35 h－1、穩定期菌數高，且乳酸最終產量可達6．5 g/L。

圖3 不同菌株生長曲線圖

圖4 不同菌株乳酸產量曲線圖

2．3 抑菌能力

致病型大腸桿菌K88/K99、多殺性巴氏桿菌、雞白痢沙門氏菌及金黃色葡萄球菌是較為常見的動物致病菌，對致病菌的抑菌活性是腸球菌作為益生菌制劑的一個必要前提［17］。由圖5可知，這7株菌對以上5株常見致病菌均有一定的抑制能力，相比對照菌Ef1．0130和其他菌株，GJ01013對5株致病菌均有較強的抑制能力，抑菌圈直徑均在15 mm以上，對大腸桿菌K88的抑菌圈直徑可達21．5 mm。

圖5 7株腸球菌對5株致病菌的抑菌活性比較

2．4 人工胃、腸液耐受性

胃液pH的大小根據飲食結構的不同而波動，通常在pH 3．0左右，這種酸性環境可以激活胃液中的胃蛋白酶原，從而殺死胃內的細菌，食物通過胃的時間相對較短，一般為1～2 h。小腸液的pH約為7．6，其中除了大量的水分外，還有各種酶、膽汁鹽等多種成分，對腸內菌群有著多方面的影響，食物通過動物小腸的平均時間約為1．5 h。因此保持一定數量的活菌數是其發揮作用的先決條件。

圖6 7株腸球菌對人工胃、腸液耐受性

由圖6可以看出7株菌對人工胃液都表現有耐受性，不同pH胃液的存活率分別在20%、50%和70%以上。對人工腸液也有一定的耐受性，存活率均在60%以上。綜合比較，菌株GJ01013耐胃、腸液能力相對較強。

3 討論與結論

Biolog自動微生物分析系統與傳統鑒定方法相比，具有快速、便捷、有效的特點，特別是對于沒有目的性的未知微生物，可為鑒定者提供方向性指導。除GJ01012的Biolog鑒定結果與16SrRNA序列分析結果不一致外，其余菌株的兩種鑒定方法結果均一致。考慮到Biolog自動微生物分析系統在其數據比對過程中記入一些非特異性的陽性反應，會造成偶然誤差，從而引起個別鑒定結果的不穩定［18］，GJ01012的鑒定結果暫以16SrRNA序列分析結果為準，還有待進一步準確印證。

上述從6日齡肉仔雞腸道中分離得到的7株腸球菌，通過體外益生性能評價后，經數據綜合分析，與對照菌株和其他菌株相比，篩選出一株Enterococcus faecium GJ01013，具有生長速度快，產L－ 乳酸能力強，能抑制致病型大腸桿菌K88/K99、多殺性巴氏桿菌、雞白痢沙門氏菌及金黃色葡萄球菌的生長和耐人工胃腸液等優良特性，為新型飼用微生態制劑的開發提供菌種來源。

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Isolation，Identification and Comparison of Probiotic Characteristics of Seven Kinds of Chicken Enterococcocci

Hui Ming1Li Liyuan1，2Zhang Xiaolin2Han Wei2Guo Weiqun2
(Institute of Biological Engineering，Henan University of Technology1，Zhengzhou 450000)
(Research Institute of State Grain Administration2，Beijing 100037)

This article studies the biological characteristics in vitro of seven enterococcocci which are isolated from the guts of 6－day－old AA broiler chickens．Selective medium is used to isolate enterococcocci and two methods that are 16S rRNA and Biolog are used to identify these strains，and the probiotic characteristics index such as growth，lactic acid production，inhibiting pathogens and tolerance of artificial gastrointestinal fluid are determined．This research finds that the seven strains are either Enterococcus faecalis or Enterococcus faecium．After comparing the performances of probiotics，an excellent strain named Enterococcus faecium GJ01013 can be obtained．It has the following characteristics:faster growth(generation time＜30 min)，shorter lag phase，better capacity of L－lactic acid production(up to 6．5 g/L)，stronger inhibitory of Escherichia coli K88/K99，Pasteurella multocida，Salmonella pullorum and Staphyloccocus aureus Rosenbach(the maximum antibacterial diameter can be up to 21．5 mm)，and higher survival rate of artificial gastrointestinal fluid(the highest survival rate is 93．5%)．Enterococcus faecium GJ01013 shows excellent performance for the exploitation of new feed probiotic products．

probiotics，Enterococcus，identification，in vitro evaluation

Q939．9

A

1003－0174(2012)07－0077－05

國家農業科技成果轉化資金項目(2009GB24490 503)，中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金課題(ZX1005)

2011－10－25

惠明，男，1969年出生，副教授，工業微生物與發酵技術

張曉琳，女，1975年出生，研究員，發酵生物技術