C型產氣莢膜梭菌致麋鹿死亡病例

劉 燕，李偉杰，普天春，趙 京，閻 鶴，楊明海，原 蕾，張成林

（1.北京動物園，北京 西城100044；2.中國獸醫藥品監察所，北京 海淀100081）

2011年初，本園飼養于十三陵繁育基地的多只麋鹿出現猝死，剖檢后發現多處臟器出血嚴重。心血涂片見到革蘭陽性呈短鏈大桿菌。腸內容物涂片也見到大量可形成芽孢的革蘭陽性菌，厭氧環境下培養出大量產氣莢膜梭菌，經PCR鑒定其血清型為C型。報告如下。

1 發病及剖檢情況

本園飼養于十三陵的麋鹿處于半散養狀態，這些麋鹿死前膘情都比較好。本次麋鹿發病非常急，幾乎可以說死前沒有觀察到任何癥狀，并且3d內該群的麋鹿死亡數量過半。剖檢發現各臟器出血嚴重。整個腸道黏膜充血，特別是小腸充血、出血，黏膜脫落，腸系膜血管努張，腸系膜淋巴結腫脹、充血，出現血灌腸現象。

2 實驗室檢驗

2.1 病原菌分離 對送檢的4頭麋鹿的臟器和腸內容物進行涂片，用革蘭和美藍染色鏡檢并分別進行培養。采用需氧培養和厭氧培養同時進行。4只麋鹿的腸內容物和1頭麋鹿的血液在厭氧條件下均分離出雙溶血環細菌。其他臟器未分離到有意義細菌。

2.2 病原菌的鑒定 對具有雙溶血環的細菌進行革蘭染色鏡檢，可見到兩端鈍圓、短粗的革蘭陽性菌，呈單個或成雙排列，具有莢膜，少數能形成芽孢。培養特性檢查將初步分離的產氣莢膜梭菌分別接種于綿羊脫纖維血瓊脂平板置于厭氧培養。結果綿羊血液瓊脂的菌落整齊、表面光滑隆起，呈乳白色大菌落，有雙層溶血環。菌落特征均符合產氣莢膜梭菌的培養性狀。選擇法國梅里埃公司的鑒定厭氧菌的試劑條API20A進行鑒定，鑒定結果為99%是產氣莢膜梭菌。

2.3 血清型鑒定 根據產氣莢膜梭菌α，β，ε，τ毒素基因cpa、cpb、etx及iA序列合成了針對4種毒素基因的4對特異引物，利用菌落多重PCR的方法，進行血清型鑒定。PCR反應總量為50μL，取一潔凈薄壁PCR管，依次加入10×PCR緩沖液（含25mmol／mL MgCl2）5μL、4 對引物（25nmol／mL）各1μL、dNTPs（10mmol／mL）2μL、雙蒸水33 μL，從4℃冰箱取出各菌株血平板培養物，用火菌槍頭挑取平板上的單個菌落，懸浮于各PCR管，于PCR儀上94℃10min預變性，冰浴2min，分別加入Taq酶（5U／μL）2μl，于PCR儀進行如下反應：94℃30s，52℃30s，72℃1min 30s，進行30個循環；然后72℃10min。PCR完成后取5μL PCR產物，在1.5%瓊脂糖凝膠中90伏30～40min，用凝膠成像系統觀察結果并拍照（見圖1）。

圖1 該菌株PCR擴增結果

產氣莢膜梭菌跟據其產生的毒素不同，可以分為5個血清型。具體分別為A型產α毒素，B型產α、β和ε毒素，C型產α和β毒素，D型產α和ε毒素，E型產α和τ毒素。每種毒素的片段大小是不同的。α毒素片段大小為324bp，β毒素片段大小為196bp，ε毒素片段大小為665bp，τ毒素片段大小為446bp。根據擴增結果，本次分離到的菌株擴增到大小分別為324bp和196bp的兩條片段，確定該株產氣莢膜梭菌為C型產氣莢膜梭菌。

2.4 藥敏試驗 選取臨床常用抗生素，進行藥物敏感試驗。藥敏試驗采取K－B法。藥敏片購自北京天壇藥物生物技術開發有限公司。結果是該菌對頭孢曲松和頭孢哌酮敏感；對慶大霉素、頭孢克圬、阿奇霉素、諾氟沙星、磺胺、紅霉素以及青霉素等均不敏感。

2.5 動物試驗 將初步分離鑒定的產氣莢膜梭菌接種于厭氣肉肝湯培養24h后，調節細菌濃度在109CFU／mL左右，分別以0.1、0.2、0.3mL三種注射量（每種注射量3只20g左右的小鼠）腹腔注射小鼠。對照組3只小鼠注射無菌的厭氣肉肝湯。結果是除對照組和1只注射0.1mL菌懸液的小鼠存活外，其余全部于12h內死亡。對死亡小鼠進行剖檢，臟器觸片和染色鏡檢，可見到與原培養物形態相同的帶莢膜的革蘭陽性短粗桿菌。說明該菌是小鼠死亡的致病菌株，并且毒力還很強。

3 結果與討論

麋鹿屬于鹿科麋鹿屬，是我國I級重點保護的瀕危野生動物。3000多年前的商代是麋鹿種群發展的鼎盛時期，隨著人類的持續獵殺和嚴重的棲息地破壞，麋鹿的野生種群于清末時期滅絕。目前，全世界現有的3 000多只麋鹿均是19世紀從我國引入到歐洲，集中散放在英國烏邦寺莊園的最后18頭麇鹿的后代。我國在北京動物園、北京麋鹿生態試驗中心等全國幾十個動物園、野生動園、保護區等有飼養。

因產氣莢膜梭菌引起的動物猝死在國內國外均有多次報道。在我國由于產氣莢膜梭菌引起的麋鹿猝死也有多次報道，但一般都是由于A型產氣莢膜梭菌引起的。C型產氣莢膜梭菌引起的麋鹿猝死的情況比較少見。本次分離到的C型產氣莢膜梭菌是本次麋鹿大量死亡的致病菌。產氣莢膜梭菌引發的動物猝死一般是因為動物在一些應激情況下或者采食情況發生變化，引起發酵產酸，使瘤胃的pH值降低，細菌產生的毒素，改變了腸道的通透性，使大量毒素進入血液，引起全身毒血癥，發生休克而死。本次疾病發生后，本園對動物尸體，以及飼養環境全都做了妥善處理，并加強防疫意識，以及飼養管理條件，盡量減少此類病情的再次發生。