纖維環切開法建立豬腰椎間盤退變動物模型

康然 黃桂成 李海聲 李青 胡春萍 劉彬彬 戚晴雪 謝林

椎間盤退變隨著年齡的增加而加重，其發生發展的病理生理學機制復雜，治療棘手[1]。隨著分子生物學及組織工程技術的發展，椎間盤內注射生長因子、干細胞及細胞支架移植促進髓核及纖維環的再生為椎間盤退變的治療提供了新的途徑[2-3]。制備一種與人類椎間盤結構、大小相似，便于操作，可靠的動物模型作為載體是研究的前提。本研究采用刀刺損傷纖維環建立了豬腰椎間盤退變模型，同時觀察穿刺針穿刺纖維環對椎間盤退變的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 健康雌性家豬6頭(由江蘇省中西醫結合醫院動物實驗中心提供)，3月齡，平均體質量(24.00 ±3.54)kg。

1.2 實驗步驟

1.2.1 術前準備:術前禁食24 h，腹腔注射3%戊巴比妥1 ml/kg，臀部肌肉注射阿托品0.05mg/kg，動物進入較好的麻醉狀態，行MRI檢查。耳緣靜脈穿刺，建立靜脈輸液通道，血氧監護，推注丙泊酚3mg/kg，氣管插管，丙泊酚20 ml/h、瑞芬太尼15 ml/h靜脈泵入。

1.2.2 手術方法:實驗豬右側臥位于透X線手術臺上，左側腰腹部常規備皮、消毒、鋪無菌手術單。切口以末節肋骨與脊柱交點前下方2 cm處開始，沿著腰椎橫突的前方3 cm向下，共15 cm。分離腹外斜肌、腹內斜肌、腹橫肌至腹膜，沿腹膜后間隙至椎體側前方，保護腹膜、腎臟、輸尿管、腹主動脈。“C”臂X線機透視定位，23號刀片于纖維環的左前外側平行于椎間隙刺入至刀柄處，長度為17 mm(術前椎間盤MRI橫斷面測量，此方向椎間盤直徑35 mm，纖維環寬6 mm)，停留5 min。或用18號穿刺針沿同樣方向穿刺，深度17 mm，停留5 s。對照組椎間盤只暴露不進行穿刺。止血，逐層縫合，包扎傷口，臀部肌肉注射青霉素320萬U。動物清醒后拔管。手術后2周6只實驗豬再次腹腔注射3%的戊巴比妥，麻醉下行MRI檢查。手術后4、6周，對其中空白1只進行MRI檢查，6周時靜脈內注射過量苯巴比妥鈉處死該頭實驗豬，取椎間盤行病理切片檢查。

1.3 指標檢測

1.3.1 MRI檢查:應用美國GE公司1.5T MRI設備檢查。參數 O-Sag T2 frFSE:TR=2800，TE=102，ETL=21，Bandwidth=41.67，Mtrix=256 ×480，Nex=2，FOV=32，thickness=3 mm，spacing=0。于正中矢狀位，選擇髓核高信號區域，測量信號值，即MEANS值。并以同一次檢查的T13～T14椎間盤信號值為基準，計算各椎間盤的相對信號強度，以消除干擾。相對信號強度=所測椎間盤信號值/T13～T14椎間盤信號值。椎間盤高度以正中矢狀位椎間隙中心為測量點，應用Centricity DICOM Viewer中Distance軟件測量。

1.3.2 病理組織學檢測:實驗動物處死后，取出整段腰椎，沿各椎體中央水平鋸開，然后縱向鋸開，保留完整椎間盤，進行大體形態觀察。甲醛液固定，硝酸脫鈣，石蠟包埋，切成6μm厚的切片。HE染色后光學顯微鏡下觀察。

1.3.3 統計學分析:所有數值采用SPSS軟件統計，椎間盤MRI相對信號強度及椎間盤高度數據以均數±標準差(珋)表示，同組前后對照采用配對t檢驗，組間比較采用方差分析，LSD及SNK分析。等級資料采用卡方檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

6頭實驗豬，末節胸椎T14至首節骶椎S1共42個椎間盤，其中對照組9個，針刺模型組8個，刀刺模型組25個。手術后4周、6周，僅1頭實驗豬的7個椎間盤列入觀察，其中對照組2個，針刺模型組2個，刀刺模型組3個。

2.1 MRI影像變化特征 造模手術后2周，刀刺模型組椎間盤MRIT2加權像信號降低、顏色灰暗，髓核縮小，纖維環面積增大，椎間盤高度降低，其余2組無明顯變化。術后4周、6周，刀刺模型組椎間盤信號進一步降低，顏色變暗變黑，髓核逐漸消失;而另外2組無明顯變化。雖然模型數量少，但仍可以看出趨勢，見圖1。

圖1 同一頭實驗豬術前、術后2周、術后4周、術后6周MRIT2加權像

2.2 椎間盤MRI信號強度及椎間隙高度變化 各組椎間盤MRI信號強度及椎間隙高度數據見表1。造模前，各組數據無顯著差異。造模手術后2周刀刺模型組椎間盤相對信號強度與其術前比較顯著降低(P＜0.01)，與手術后2周其余2組比較差異亦顯著(P＜0.01)。造模手術后2周刀刺模型組椎間盤高度與其術前比較顯著降低(P＜0.01)，與手術后2周其余2組比較差異亦顯著(P＜0.05)。針刺模型組術后2周，椎間盤高度稍有降低，但與手術前比較無差異。

表1 椎間盤MRI信號強度及椎間隙高度變化

表1 椎間盤MRI信號強度及椎間隙高度變化

注:與術前比較，＊＊P＜0.01;與其他2組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別MRI 相對信號強度 椎間盤高度(mm)術前 術后2周 術前 術后2周對照組(n=9)1.00±0.08 0.98±0.14 2.82±0.60 2.96±0.77針刺模型組(n=8) 0.99±0.14 0.92±0.12 2.81±0.56 2.44±0.37刀刺模型組(n=25) 0.98±0.13 0.77±0.17＊＊△△ 2.64±0.41 1.98±0.32＊＊△

2.3 椎間盤退變MRI評分 參照Pfirrmann分級系統分級比較[4]。各組椎間盤手術前均為Ⅰ級，手術后2周Pfirrmann分級情況，見表2。造模手術后2周，刀刺模型組相比其他2組退變迅速，差異顯著(P＜0.01)。對照組和針刺模型組之間無明顯差異。

表2 手術后2周Pfirrmann分級(n，%)

2.4 組織病理學表現 大體觀察可見對照組及針刺模型組椎間盤髓核組織為透明膠凍狀，椎間隙清晰，纖維環及髓核的界限清楚(圖2)。刀刺模型組不能分辨髓核組織，纖維環及髓核無明顯界限(圖3)。鏡下見，對照組及針刺模型組髓核細胞均勻分布，形態正常，纖維環呈板層結構;刀刺模型組髓核組織縮小，細胞密度小，纖維向內塌陷，纖維環板層出現明顯斷裂，并可見纖維環內層有少量毛細血管生長(圖4)。

圖2 對照組椎間盤組織大體形態

3 討論

椎間盤退變是臨床常見腰腿痛疾患的主要病因，其機制復雜，治療棘手，為脊柱相關疾病研究的熱點。椎間盤的退變應該區別于椎間盤的生長、老化以及生理適應性改造，它應該與臨床上的功能障礙和疼痛相關[5]。年齡增加引起的改變，如細胞基質組成改變，從出生就開始出現[6]，并不和疼痛相關[7];年齡增加，椎間盤終板血管減少和椎間盤內細胞密度下降，只是反應了椎間盤對增加的機械負荷和較低代謝轉運的必要適應;年齡增加，椎間盤內微小裂隙的逐漸增多，這種裂隙在所有的椎間隙水平均存在，并可能在以后的時間里變成更大的裂隙，但只要這種裂隙保持不發展擴大，它對椎間盤的功能就不會有影響[8]。細胞代謝的指標，如細胞因子、基質金屬蛋白酶活性的變化[9]，它們與椎間盤結構的損壞相關[10]，如果我們把椎間盤的退變歸咎于這些指標，那么就像把戰爭歸咎于士兵一樣。模仿關鍵病理因素是本研究制備動物模型的思路。

結構的破壞在椎間盤退變中起著決定性的作用，手術破環椎間盤終板或纖維環可以導致椎間盤退行性改變的發生。終板損傷模型，通過在椎體側方途徑穿刺終板，引起髓核的壓力降低，蛋白多糖流失和纖維環內層結構的破裂[11]。纖維環損傷模型，是模仿纖維環周圍的裂隙，引起繼發的髓核及終板的改變[12-13]，導致出現椎間盤的退行性表現。向椎間盤內生長的神經及血管是損傷椎間盤在結構上的重要特點，不同程度上，直接和疼痛相關[14]。纖維環后方和后縱韌帶受竇椎神經(一種自主神經和軀體神經的混合神經，具有傷害感受器)支配，但在椎間盤的前方以及側方受自主神經的支配。具有傷害疼痛感受器的神經纖維僅僅穿越纖維環最外層的1～3 mm[15]，在嚴重損傷的椎間盤中，這些神經可以延伸到髓核和椎體的前方，在椎體終板中也有相似密度的神經分布[16]。椎間盤內正常壓力的喪失，促使了這種生長，降低的蛋白聚糖含量也有助于神經和毛細血管的長入[17-19]。本研究針對椎間盤退變的決定性病理因素，破壞椎間盤結構，刀片切開纖維環造模，6周后髓核消失，椎間隙變小，髓核陷窩為纖維組織代替，纖維環內出現明顯的裂隙，并有小血管長入纖維環的內層，符合椎間盤退變的病理特征。但未見神經長入，可能與神經生長緩慢有關。

MRI已成為診斷椎間盤退行性改變最精確的檢查手段之一[4]。MRI能夠描述椎間盤的水分含量以及形態學變化。與退變有關的椎間盤生化和結構的改變在T2像上表現為髓核信號強度明顯降低，椎間高度下降。由于各節段椎間盤在磁場中所處的位置存在一定差異和儀器本身存在的不穩定因素，參考文獻方法[18]，本研究以正中矢狀位T13～T14正常椎間盤髓核信號作為對照標準，所得相對信號強度值，更加準確、客觀。本研究中采用23號手術刀片全程穿刺纖維環，2周時MRI即可檢測到椎間盤的退行性改變，髓核信號降低，椎間隙高度下降，纖維環向外、向內擴展。Pfirrmann分級，刀刺模型組椎間盤出現明顯的退變。采用18號針穿刺纖維環組沒有上述病理及MRI檢測的明顯變化，可能與豬的椎間盤較大，刺針的直徑未達到椎間盤高度的40%有關[19]，同時也說明適當大小的穿刺針，可以進行椎間盤的穿刺注射治療，對椎間盤無損傷。

椎間盤退變是一個緩慢的過程，在年輕人中，終板損傷需要幾年的時間才能表現出椎間盤退變的現象[20]。動物實驗通過人為的損傷干預，加快退變過程，可以檢測到椎間盤退變的時間跨度從1周到幾個月[12-14]。本實驗中刀片直接刺穿纖維環，2周即可從MRI上檢測到退變現象，退變程度集中在PfirrmannⅡ、Ⅲ級，隨著時間的推移逐漸加重。本模型造模周期短，干擾因素少，退變程度較一致，便于進行治療干預療效的比較。

鼠、兔、豬、羊等多種動物被用來進行椎間盤退變模型的制備[21-22]。小動物椎間盤退變模型的缺陷是椎間盤具有較高的細胞密度，較好的代謝轉運途徑，成年椎間盤中脊索細胞的存在[23]，這些差別，使得它們具有較好的椎間盤修復能力，與人類差別較大。豬為大型哺乳動物，其脊柱的形態及大小與人類相似，是理想的模型來源。豬的椎間盤較大，便于操作，適合進行椎體融合，椎間盤的穿刺、注射，纖維環修復等研究。此類實驗常為腰椎腹膜后入路，切口較長，大多選擇母豬，因為母豬的輸尿管相比公豬在手術中更不容易被損傷[24-25]。本實驗中無1例出現輸尿管損傷。

豬的解剖跟人很接近，腹膜后入路暴露椎間盤，臨床脊柱外科醫師一般很容易操作。造模手術中動物的麻醉及監護需要充分準備，由于是大型動物實驗，代價較高，單純使用戊巴比妥腹腔或靜脈注射，麻醉深度較難控制，效果不佳，比較危險，本研究預實驗中2頭實驗豬因麻醉意外死亡。而全麻下動物麻醉狀態良好，相對安全。豬為雜食性動物，胃腸內可能殘留影響MRI檢測的雜物，實驗之前必須禁食較長時間，以免影響檢查，同時手術中予以足夠的靜脈補液。確保動物的安全，是造模成功的前提。

刀刺損傷豬椎間盤纖維環可以在較短的時間內成功建立椎間盤退變模型。MRI及病理表現與人類的椎間盤退變相似。手術操作相對簡單，易于復制，模型個體間差異小，造模成功率高。與人類相仿的椎間盤形態及大小，為進行椎間盤退變的穿刺注射治療，髓核、纖維環及終板的再生研究提供了合適的實驗載體。

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