加味四君子湯對增齡大鼠免疫系統的調節作用及其初步機制探討

沈鶴 張力華 何學斌 郝棟 董玲玲

炎性衰老(inflamm aging)這一概念的核心就是機體的炎癥穩態隨著增齡而逐漸出現失衡，機體的促炎性反應與抗炎性反應的平衡也出現失調[1-2]。

有相關研究發現，白介素-2(IL-2)及其受體在老年機體中的表達水平明顯下降[3-4]。夏世金等[2]研究發現在炎性衰老的進程中，TNF-α蛋白的表達明顯增加，說明促炎性細胞因子的蛋白正處于高表達狀態、機體也處于一種高促炎性反應狀態，機體的促炎性反應和抗炎性反應出現了平衡失調，從而加重了衰老發展的進程[5]。

多項研究表明，四君子湯具有多方面的生理活性，主要表現為可以調節機體各個器官的功能，增強免疫功能及抗氧化能力和應激能力，從而起到延緩衰老的作用[5]。

本研究旨在探討加味四君子湯對增齡大鼠免疫系統的調節作用和改善大鼠免疫系統增齡變化的可能作用機制，為進一步臨床應用防治或延緩衰老進程提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 動物 50只12月齡健康Wistar大鼠(湖北省醫學科學院實驗動物中心提供，雌雄各半，體質量(370±50)g。10只3月齡健康Wistar健康大鼠，雌雄各半，體質量(170±10)g。各組大鼠在大致相同條件下，分籠飼養于華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院清潔動物實驗室，室溫(22±3)℃，相對濕度(65±5)%，通風良好，光照時間按照正常晝夜節律調節，標準飼料喂養，自由飲水、攝食，無不良因素影響。

1.2 藥品制備與試劑 加味四君子湯由黨參、白術、茯苓、甘草、黃芪組成，中藥飲片購于武漢龍泰藥業有限責任公司(產品批號:100101);經水煮醇沉法制備成含生藥1 g/ml的藥液，然后分別加入蒸餾水配置成試驗所需的低、中、高不同濃度即0.25、0.5、1.0 g/ml的溶液，用無菌容器分瓶裝入高溫高壓消毒后，于4℃保存，每次使用前加熱至37℃。陽性對照組藥物為河南皖西制藥股份有限公司生產的六味地黃丸，將“六味地黃丸”丸劑研磨呈細粉狀，加入蒸餾水煎煮，配制成含藥0.24 g/ml的混懸液，每周制備1次備用，于4℃保存，每次使用前加熱至37℃。免疫球蛋白IgG檢測試劑盒購自寧波美康生物科技公司。檢測IL-2和TNF-α的免疫組化試劑一抗、二抗均購自北京奧博森生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及藥物處理:將50只12月齡大鼠隨機分為5組:藥物低劑量組、中劑量組、高劑量組、陽性對照組、老年對照組，每組各10只，雌雄各半;3月齡Wistar大鼠10只作為正常青年對照組，雌雄各半。每日由梨園醫院老研所動物房提供(購于湖北省醫科院)的普通大鼠顆粒飼料及自來水。各組大鼠分別給予相應藥物灌胃，依據實驗大鼠與人體的體重藥物比例系數換算，藥物低、中、高劑量組:每日灌服1.6、3.2、6.4 g/kg。陽性對照組:給予六味地黃丸混懸液1.5 g/kg。老年對照組:給予生理鹽水2 ml。每只大鼠分別于每日清晨進食前灌胃1次。每周稱重1次，依據大鼠體重調整給藥劑量，按照此法連續給藥90 d。灌胃期間，因灌胃操作技術等原因藥物低劑量組和老年對照組分別死亡2只和1只大鼠。

1.3.2 標本采集及處理:末次給藥24 h后，空腹稱量體重，于眼球后采血并用試管留置血樣，處理后放置－20℃冰箱中保存，用于檢測血清IgG的含量;摘除眼球后放血處死大鼠，于冰臺上迅速剪開胸、腹腔，游離并摘除胸腺、脾臟，電子天平稱量濕重，用于計算胸腺指數和脾臟指數;將胸腺和脾臟沿正中剖開，一部分置于20倍體積的4%多聚甲醛溶液中固定，以備用于常規石蠟包埋進行光鏡與免疫組化檢測。

1.3.3 觀察指標及檢測方法

1.3.3.1 血IgG測定:應用酶法在全自動生化分析儀上測定大鼠血清IgG含量。

1.3.3.2 胸腺指數和脾臟指數的測定:

胸腺指數=胸腺濕重(mg)/大鼠體重(g)。脾臟指數=脾臟濕重(mg)/大鼠體重(g)。

1.3.3.3 胸腺、脾臟組織形態學觀察:將在多聚甲醛中固定后的胸腺、脾臟組織石蠟包埋，切片后以HE染色，光鏡下觀察組織的形態學改變。

1.3.3.4 胸腺IL-2、脾臟TNF-α表達檢測:采用鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶法，陰性對照以磷酸鹽緩沖液代替一抗。實驗步驟嚴格按照使用說明書進行。應用同濟醫學院全自動醫學彩色圖文報告分析系統進行圖像采集和結果數據分析。應用統計分析軟件求得平均光密度值(OD)及灰度值，進行免疫組化染色半定量分析。

1.4 統計學處理 應用SPSS 15.0統計軟件進行統計學處理，計量資料用均數±標準差(珋)表示;多組間均數的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，用最小有意義差異法(LSD)進行兩兩比較，以P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清IgG含量的比較 與青年對照組比較，增齡各組大鼠IgG水平均明顯降低(P＜0.01);與老年對照組比較，陽性對照組和藥物組的中劑量組和高劑量組的IgG明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)。與陽性對照組比較，藥物組的IgG含量降低(P＜0.01)。見表1。

表1 各組免疫指標比較

表1 各組免疫指標比較

注:與青年組比較，＊＊P＜0.01;與老年對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01;與陽性對照組比較，##P＜0.01

組別 例數(n) IgG(g/L) 胸腺指數 脾臟指數 IL-2(OD) TNF-α(OD)青年對照組 10 6.01±0.51 1.78±0.44 5.32±0.26 0.27±0.05 0.31±0.04老年對照組 9 4.23±0.63＊＊ 0.49±0.23＊＊ 3.59±0.87＊＊ 0.13±0.01＊＊ 0.32±0.05＊＊陽性對照組 10 5.35±0.59＊＊△△ 0.49±0.35＊＊ 3.61±0.70＊＊ 0.17±0.00＊＊△△ 0.28±0.03＊＊△△藥物低劑量組 8 4.23±0.52＊＊## 0.75±0.31＊＊△△##3.60±0.83＊＊ 0.14±0.00＊＊△△##0.28±0.08＊＊△△##藥物中劑量組 10 4.39±0.31＊＊△## 0.63±0.35＊＊△△##3.15±0.68＊＊△△##0.26±0.09＊＊△△##0.28±0.08＊＊△△##藥物高劑量組 10 5.13±0.40＊＊△△##0.80±0.14＊＊△△##3.82±0.77＊＊△△##0.20±0.09＊＊△△##0.29±0.04＊＊△△##

2.2 各組大鼠胸腺指數、脾臟指數的比較 與青年對照組比較，增齡各組大鼠胸腺指數均顯著降低(P＜0.01);與老年對照組相比較，陽性對照組的胸腺指數無顯著性差異，藥物組的胸腺指數升高(P＜0.01)，以高劑量組升高最為顯著;與陽性對照組相比，藥物組胸腺指數升高(P＜0.01)。見表1。

與青年對照組比較，增齡各組大鼠脾臟指數均顯著降低(P＜0.01);與老年對照組比較，陽性對照組和藥物低劑量組的脾臟指數無明顯差異(P＞0.05)，中劑量組的脾臟指數顯著降低(P＜0.01)，高劑量組的脾臟指數顯著升高(P＜0.01);與陽性對照組相比較，藥物組低劑量組脾臟指數變化無明顯差異(P＞0.05)，中劑量組的脾臟指數顯著降低(P＜0.01)，高劑量組的脾臟指數顯著升高(P＜0.01)。見表1。

2.3 胸腺組織形態學變化 增齡各組大鼠的胸腺組織與青年組相比明顯萎縮，大部分的胸腺組織被結締組織和脂肪組織所替代，胸腺的皮質、髓質明顯變薄，可見少量的淋巴細胞及大量的漿細胞和巨噬細胞，小葉內的胸腺細胞數量明顯減少，排列比較稀疏。與老年對照組比較，藥物組和陽性對照組胸腺上述病理改變均有不同程度的減輕，胸腺細胞分布較密，著色良好。

2.4 脾臟組織形態學變化 增齡各組大鼠脾臟組織的結構紊亂，白髓和紅髓的分界不清楚，白髓減少，巨噬細胞和中性粒細胞數量增多，淋巴細胞排列比較疏松，白髓中的纖維減少、紅髓中的纖維增多、變粗。與老年對照組相比較，藥物組和陽性對照組脾臟鏡下觀上述形態學改變有一定的改善，但白髓和紅髓的分界欠清晰，白髓略微增多。

2.5 胸腺IL-2表達 青年組大鼠可見IL-2陽性細胞在胸腺內分布不十分均勻，在髓質中的分布比較密集，大部分集中在皮質和髓質的交界處以及髓質處;陽性細胞的胞漿被染成棕色或棕褐色顆粒，陽性表達的強弱程度不等;細胞的胞體比較大，形態各異;在細胞之間可以見到大量的、散在分布的陽性分泌物。

與青年對照組比較，增齡各組的胸腺組織的IL-2染色強度顯著降低(P＜0.01);與老年對照組比較，陽性對照組和藥物組的IL-2表達強度顯著升高(P＜0.01)。中劑量組明顯高于低劑量組和高劑量組;另外，與陽性對照組比較，高劑量組和中劑量組的表達明顯升高，低劑量組的表達明顯降低。見表1。

2.6 脾臟TNF-α表達 TNF-α表達在脾臟組織細胞的細胞膜和細胞漿中，其陽性信號主要位于中性粒細胞、單核巨噬細胞內，呈均勻的黃色或棕褐色細顆粒狀。與青年對照組比較，老年對照組脾臟組織的TNF-α染色光密度顯著增強(P＜0.01)。與老年對照組比較，藥物組和陽性對照組表達量顯著降低(P＜0.01)。TNF-α在低、中、高劑量組脾臟組織均可見陽性表達，其中低劑量組，中劑量組和高劑量組的表達量大致相同，高劑量組的表達量最高。中劑量組脾臟組織陽性表達量與陽性對照組無顯著差異(P＞0.05)。見表1。

3 討論

免疫衰老即免疫系統隨著年齡的增長而發生的進行性退變，這種改變的逐漸積累則導致機體對感染和接種疫苗應答能力的降低[7]。隨著年齡的增加，免疫器官老化，吞噬細胞的吞噬功能降低，細胞遷徙特性改變、細胞類群和數量以及抗體產生的能力等也發生相應變化，從而增加感染、細胞惡變和自身免疫性疾病的機會[8]。胸腺和脾臟是機體的免疫器官，胸腺隨年齡的增長而逐漸萎縮，結果導致免疫功能下降。脾臟有合成和分泌免疫物質的功能，老年人的脾臟萎縮，同樣導致免疫功能下降，免疫功能下降是造成機體衰老的原因之一[8]。

四君子湯為延緩衰老的代表方劑，作用緩和，療效確切。四君子湯(人參、白術、茯苓、甘草)的近期研究結果證明，該方能夠降低脂質過氧化物的含量和升高血清超氧化物酶的活力，具有抗自由基損傷的功能;可明顯改善衰老小鼠的肝細胞超微結構，使其恢復正常狀態;顯著延長脾虛小鼠生命活力，增加其胸腺質量，提高免疫功能，降低實驗動物血清中LEP和肝中脂褐素含量[5]。

本研究證實了加味四君子湯多途徑、多環節、多靶點的整體調節機制。具有顯著的延緩衰老的作用，其作用的發揮是通過多層次而實現的，其中包括調節免疫球蛋白、提高中央和外周免疫器官的功能、和改善因衰老所致的細胞形態學異常改變等方面。其發揮延緩衰老的作用往往以中、高劑量表現得更為全面和穩定，提示其在一定范圍內呈量效關系。加味四君子湯具有提高老齡大鼠胸腺組織IL-2的水平，上調脾臟組織TNF-α表達的作用，從而說明延緩衰老作用的機理之一可能與提高免疫細胞因子的含量，控制免疫器官的炎性表達作用相關。同時可改善衰老大鼠胸腺和脾臟的組織學超微結構，通過維持細胞形態的正常，以確保其各項功能的發揮，從而起到延緩衰老的作用，這可能是其作用途徑之一。研究結果表明，加味四君子湯具有一定的延緩老齡大鼠免疫系統炎性衰老的作用。

本實驗研究了隨著老齡大鼠的衰老變化，加味四君子湯具有延緩大鼠免疫系統衰老的作用，并探討了其可能的作用機理。既為運用提高機體免疫功能原理延緩衰老提供了的理論依據，又為本復方臨床應用提供了實驗證據;既拓展了中醫藥防治衰老的思路，亦為該中藥復方制劑的進一步研發奠定了前期工作基礎。但本研究工作還只是初步研究，還未能進行更加深入的機理探討。如果能應用先進的分子生物學技術，在基因水平上進行深入研究，闡明加味四君子湯更加具體的分子水平的延緩衰老的作用機制，將促進延緩衰老中藥現代機理研究及臨床推廣應用。

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