HPV16／18感染、細胞增殖及凋亡在尖銳濕疣復發中的作用

吳 迪，吳 嚴，張曉冬

（1.北華大學附屬醫院 皮膚科，吉林 吉林132013；2.中國醫科大學附屬一院 皮膚科，遼寧 沈陽110001）

尖銳濕疣（condylomata acuminate，CA）是由人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染引起的一種以乳頭瘤樣增生性為特征的疾病，易于復發。與CA密切相關的 HPV主要有6、11、16、18型，其中 HPV6、11為低危型病毒，多見于良性病變，而HPV16、18型為高危型病毒，多存在于宮頸癌等惡性腫瘤中。有研究應用免疫組化方法和蛋白質免疫印跡法檢測到CA組織中細胞增殖相關蛋白DNA拓撲異構酶及增殖性核抗原表達增強［1］；亦有研究采用原位特異性DNA片斷標記法及免疫組化方法檢測到CA皮損中角質形成細胞的細胞凋亡及與凋亡正相關的caspase－3表達顯著增加［2］。因此，CA的發病除與HPV感染有關，還與細胞增殖和細胞凋亡紊亂密切相關。

本研究采用熒光定量PCR及流式細胞儀對復發型CA皮損進行HPV16／18、細胞增殖及細胞凋亡檢測，以探討CA的復發機制及癌變潛在性。

1 材料與方法

1.1 CA病例 所有患者均來自我院皮膚性病科門診，經臨床及／或病理明確診斷為CA，均為復發病例。共63例，其中男性37例，女性26例；年齡18～56歲，平均23.93±7.45歲；病程2個月～35個月，平均5.19±2.13月。

1.2 分組 按疾病復發病史遷延時間，將CA患者分為3組：A組為3個月以內，共23例；B組為3個月～6個月，共25例；C組為6個月以上，共15例。另取包皮環切術包皮組織做為對照組，共10例

1.3 CA患者標本采集 用生理鹽水浸潤的無菌棉簽用力反復擦拭疣體表面3次，將棉簽放入裝有1ml生理鹽水的無菌試管中。疣體常規碘伏消毒，2%利多卡因局部浸潤麻醉，以齒鑷夾住疣體，用多功能電離子手術治療機（GX－3，廣西科學院應用物理研究所）燒灼皮損根部，取下組織塊，放入裝有足量生理鹽水的試管中。

1.4 熒光定量PCR檢測 貼試管壁擠出取樣后棉簽中的液體，棄棉簽，取100μl待測液體，13 000 rpm離心10min，棄上清，PCR樣品處理管中加入50μl樣品裂解液充分振蕩混勻，100℃煮沸10min，13 000rpm離心10min，取上清2μl作為反應模板。按HPV16／18型核酸擴增熒光檢測試劑盒（深圳匹基生物工程公司）進行PCR基因擴增。循環參數：預變性為93℃5min，PCR循環為37℃3min、93℃1min、93℃5min、60℃40min，共循環43次。

1.5 流式細胞儀檢測 將疣體組織塊剪碎研磨，濾紙過濾，1 000rpm離心5min，棄上清，用磷酸鹽緩沖液4ml漂洗，1 000rpm離心5min，棄上清，碘化丙啶染色半小時，上機（EPICS XL流式細胞儀，美國貝克曼公司）檢測S期細胞百分率和凋亡細胞BAD值。

1.6 數據處理 采用SPSS 14.0軟件包進行處理。等級資料采用χ2檢驗進行組間比較，計量資料中的偏態分布資料采用非參數檢驗、正態分布資料采用方差分析，各指標相關性采用Spearman相關性檢驗。P＜0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 HPV16／18檢測 對照組和CA組 HPV16／18陽性檢出率分別為0%和6.4%，二者相比差異無統計學意義（χ2＝0.63，P＞0.05）。CA 組中，C組陽性率最高，三組間有顯著差異（χ2＝6.492，P＜0.05）。

2.2 S期細胞百分率 對照組和CA組S期細胞百分率分別為2.01%和6.22%，前者顯著低于后者，差異具有統計學意義（Z＝4.829，P＜0.05）。CA組中，A組最低、C組最高。三組間兩兩相比差異均具有統計學意義（F＝43.80，P＜0.05）。B組中的1例及C組中3例HPV16／18陽性者S期細胞百分率分別為8.97%及9.34%～10.15%。HPV16／18陽性CA患者S期細胞百分率（9.28%）明顯高于陰性患者（5.95%），差異具有統計學意義（Z＝3.270，P＜0.05）。

2.3 凋亡細胞BAD值百分率 對照組和CA組BAD值百分率分別為5.09%和52.48%，前者顯著低于后者，差異具有統計學意義（Z＝5.054，P＜0.05）。CA組中，A組最高、C組最低。三組間兩兩相比差異均具有統計學意義（F＝1471.09，P＜0.05）。B組中的1例及C組中3例HPV16／18陽性者BAD百分率分別為42.60%及36.58～37.4%。HPV16／18陽性CA患者BAD百分率（38.44%）明顯低于陰性患者（53.70%），差異具有統計學意義（Z＝2.946，P＜0.05）。

表1 CA復發患者及對照組三項指標檢測結果

2.4 CA患者各指標相關性 所有CA患者HPV16／18陽性率與S期細胞百分率呈正相關，相關系數為0.415（P＜0.05）；與凋亡細胞BAD值百分率呈負相關，相關系數為－0.374（P＜0.05）。其中，C組患者HPV16／18與S期細胞百分率相關系數為0.656（P＜0.05）、與凋亡細胞BAD值百分率相關系數為－0.677（P＜0.05）。所有CA患者S期細胞百分率與凋亡細胞BAD值百分率呈負相關，相關系數為－0.762（P＜0.05）；其中，A組患者相關系數為－0.313（P＞0.05）、B組為－0.226（P＞0.05）、C組為－0.519（P＜0.05），即C組相關性最大，且僅C組具有統計學意義。

3 討論

本研究中，對照組及CA復發3個月以內者均未檢出HPV16／18，CA復發3個月～6個月者25例中有1例檢出，而復發6個月以上者僅15個人即檢出3例，出現了病程越長HPV16／18檢出率越高的趨勢，由于HPV16／18為高危型病毒，復發次數越多、病程越長則發生癌變可能性越大。相關性分析發現，HPV16／18陽性率與代表細胞增殖的S期細胞百分比呈顯著正相關，而與代表細胞凋亡的BAD值百分率呈顯著負相關，且復發6個月以上者相關性最大。另外，HPV16／18陽性者S期細胞百分比顯著高于、BAD值百分率顯著低于HPV陰性者。提示HPV16／18感染、細胞增殖、細胞凋亡三者在CA復發乃至癌變起相互聯系發揮作用。

CA患者疣體組織細胞增生程度及凋亡細胞百分比均比正常人顯著增高，提示當CA患者HPV感染后，疣體組織細胞增殖與凋亡均增強。正常狀態下，細胞增殖與細胞凋亡是一對并存的矛盾，二者維持動態平衡。CA在臨床上表現為增殖反應，同時伴有增高的細胞凋亡，后者可限制其發生癌變；但如果組織過度增殖而抑制細胞凋亡時則可能導致CA組織癌變。本研究中，病情反復發作長達6個月以上者S期細胞百分比顯著高于病程短者，而凋亡細胞BAD值百分比顯著低于病程短者，且其HPV16／18陽性率顯著增高，均提示此部分患者存在潛在癌變的可能性。

CA患者疣體組織中存在增強的細胞凋亡，是由于病毒感染能直接誘導凋亡［3］。HPV感染后細胞凋亡增加可能起到平衡疣體組織過度增生和調節表皮細胞過度分化的重要作用［4］。同時，CA疣體組織中凋亡在限制病毒的繁殖上也起了重要作用，因為表皮細胞適度的出現凋亡，在某種程度上自動控制了病毒在細胞內不斷增長和擴散［5］。臨床上，某些CA患者疣體可長時間保持穩定，不再繼續增長，少數疣體可自行消退，而且外陰CA患者癌變率底，可能均與CA疣體組織中細胞凋亡增強有關。

綜上，與對照組織相比，CA組織的細胞增殖和凋亡均明顯增強；與病程較短者相比，病程遷延時間越長，CA組織中HPV16／18感染參與的可能性越大，細胞增殖越明顯，細胞凋亡則減弱，疣體組織癌變潛在危險因素增加。探討HPV16／18、細胞增殖、細胞凋亡有CA復發中的作用，有助于了解CA的發病及復發機制，為臨床治療及預防復發提供有益的思路。

［1］王 俐，駱建民，黃 雄.DNA拓撲異構酶及增殖性核抗原在尖銳濕疣中的表達［J］.中華皮膚科雜志，2002，35（4）：304.

［2］熊 芬，項 彤，眭維恥.尖銳濕疣細胞凋亡與caspa se－3、bc1－2的表達［J］.皮膚病與性病，2006，28（4）：4.

［3］Tmler M，thome M et al.Inhibition of death receptor signals by cellular FLP［J］.Nature，1997，388（6638）：190.

［4］Isaccon C，Kessis TD，Hedrick L，et al.Both cell proliferation and apoptosis increases with lesion grade in cervical neoplasia but not correlate with human papillomavirus type［J］.Cancer res，1996，56：669.

［5］Tsaceson C，Kessis TD，et al.Both cell proliferation and apoptosis increase with lesion grade in cervical neoplasia but not correlate with human papillomavirus type［J］.Cancer res，1996，56（4）：669.