蘆丁對大鼠腸缺血再灌注損傷的保護作用

黃金珠

蘆丁對大鼠腸缺血再灌注損傷的保護作用

黃金珠

目的觀察蘆丁對腸缺血再灌注損傷的保護作用，探討其可能的機制。方法 將40只健康Wistar大鼠隨機分為4組(每組10只)：A組為假手術對照組，B組為缺血再灌注組，C組為缺血再灌注+維生素C組，D組為缺血再灌注+蘆丁組。所有大鼠均行開腹手術并分離腸系膜上動脈。A組不夾閉腸系膜上動脈，B組、C組、D組夾閉腸系膜上動脈45 min，再復灌60 min。C組于復灌前10 min靜脈給予維生素C注射液180mg/kg，D組于復灌前10min靜脈給予蘆丁注射液50mg/kg。復灌60min后由腹主動脈穿刺采血制備血清檢測SOD、MPO、D-乳酸、內毒素，處死動物取小腸組織，制備腸組織勻漿檢測SOD、MPO。結果B組與A組相比，B組大鼠血清及腸組織中SOD含量明顯減少，MPO水平增高，血清中D-乳酸和內毒素的水平增高;D組與B組比較，D組中血清及腸組織的SOD含量顯著增加，MPO水平下降，血清中的D-乳酸和內毒素水平有所減少，并且，D組血清及腸組織的SOD含量高于C組，MPO的水平低于C組，血清中D-乳酸和內毒素的水平比C組低。結論蘆丁具有保護腸缺血再灌注損傷的作用，其機制可能是降低氧自由基的水平，恢復SOD活性，抑制脂質過氧化反應，保護了腸道屏障功能，使得細菌“移位”減少，并抑制炎癥反應。

腸缺血再灌注;蘆丁;超氧化物歧化酶;D-乳酸;內毒素;髓過氧化物酶

各種原因導致缺血時，組織器官會出現細胞代謝障礙和結構破壞等損傷，而當恢復血流時，上述損傷反而進一步惡化，這種現象稱為缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)。腸道是缺血再灌注損傷發(fā)生的高危場所，尤其在一些較為嚴重的臨床疾病如休克、感染、創(chuàng)傷、手術、心肺功能不全等的發(fā)生發(fā)展中，腸缺血再灌注損傷成為這些疾病惡化的助推器。腸缺血再灌注時不僅損傷腸道本身，還會因為屏障功能的損壞，導致腸內大量細菌和毒素入血，進而使網狀內皮系統產生一系列反應，釋放出更多的細胞因子和炎癥介質，引發(fā)膿毒血癥、全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)和多臟器功能不全綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)。預防與阻止上述嚴重問題的發(fā)生與發(fā)展是當今臨床工作中面臨的難點與焦點，因此腸組織成為研究探討缺血再灌注損傷的重要方向之一。

蘆丁(rutin)又名蕓香苷、紫槲皮苷，屬于黃酮類化合物，具有抗自由基活性、抗脂質過氧化作用、抑制血小板激活因子(PAF)、抑制低密度脂蛋白的氧化修飾、抑制醛糖還原酶、舒張血管、降低毛細血管通透性和脆性等藥理活性，已廣泛應用于臨床［1］，但目前用于腸缺血再灌注損傷方面的報道較少見。本實驗旨在通過動物模型，觀察蘆丁在大鼠腸缺血再灌注損傷中的作用效果，以探究其可能的保護機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型制作 40只健康Wistar大鼠(不限♀♂)，體重220～280 g，由華中科技大學同濟醫(yī)學院提供。所有大鼠均無消化道癥狀，未使用過抗生素及影響腸道菌群的藥物。隨機將大鼠分為4組，每組10只。所有大鼠禁食12 h，飲水自由，稱重后腹腔內注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉。將大鼠仰臥固定，腹部脫毛并消毒，取上腹正中部位切口進腹，暴露出腸系膜上動脈(superiormesenteric artery，SMA)。A組：假手術對照組，開腹后只分離出腸系膜上動脈;B組：缺血再灌注組，用無創(chuàng)動脈夾夾閉腸系膜上動脈根部造成缺血，45 min后去掉動脈夾，使血液再灌注60 min;C組：缺血再灌注+維生素C組，手術同B組，在松夾之前10 min經股靜脈給予維生素C注射液180 mg/kg;D組：缺血再灌注+蘆丁組，手術同B組，在松夾之前10 min經股靜脈給予蘆丁注射液50 mg/kg。

1.2 標本采集 松夾60 min后，由腹主動脈穿刺采血4 m l，靜置30 min，離心(3000r/min)10 min，取上清液，即血清，-70℃保存?zhèn)溆谩２裳筇幩来笫螅嚯x盲腸10 cm處取長4 cm的小腸一段，剪開清洗后，精確秤取0.2 g，添加2 ml 4℃生理鹽水，低溫下勻漿30秒，保持4℃離心(4500 r/min)30 min，取上清液，即腸組織勻漿，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 檢測指標 檢測血清和腸組織中超氧化物歧化酶(SOD)、髓過氧化物酶(MPO)，血清 D-乳酸、內毒素水平。采用SOD、D-乳酸、內毒素、MPO測定試劑盒，按照說明書進行操作。

1.4 統計學處理 采用SPSS 18.0統計軟件包進行數據分析。所有數值用均數±標準差(±s)表示。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清及腸組織中SOD含量見表1。

表1 SOD levels in the serum and intestinal tissue(±s)

表1 SOD levels in the serum and intestinal tissue(±s)

注：B組與A組比較，*P＜0.05;C組與B組比較，D組與B組比較，▲P＜0.05;D組與C組比較，△P＜0.05

組別 樣本例數n 血清SOD(U/ml) 組織SOD(U/mg prot)A 10 69.182±6.455 434.386±15.676 B 10 32.456±6.348* 349.487±22.593*C 10 53.730±5.258▲ 389.362±21.691▲D 10 66.758±5.232▲△ 433.790±27.269▲△

3 討論

腸缺血再灌注損傷發(fā)生機制非常復雜，但大量氧自由基產生的破壞作用已經明確［2］。超氧化物歧化酶(SOD)是內源性抗氧自由基物質，如果氧自由基生成過多，那么SOD就會被大量消耗掉，我們把SOD活性的變化作為觀察缺血再灌注中氧自由基產生的指標。本實驗顯示，B組大鼠血清和組織中的SOD活性明顯低于A組(P＜0.05)，說明在腸缺血再灌注中有大量的氧自由基產生。而C組和D組大鼠血清和組織中SOD活性均高于B組(P＜0.05)，說明維生素C和蘆丁均具有抗氧化的作用，并且蘆丁的抗氧化能力強于維生素C(P＜0.05)。這與前人對蘆丁抗氧自由基的研究結果相一致［3］。

人體不會產生D-乳酸，它是由消化道內的定植細菌產生，如克雷伯桿菌、大腸桿菌等。病理情況下，如嚴重創(chuàng)傷、休克、胰腺炎等，腸道黏膜保護屏障被破壞，D-乳酸就會進入循環(huán)血液，并且人體也不能或僅能緩慢把它代謝掉。經動物實驗研究發(fā)現，急性腸道缺血可使D-乳酸含量迅速升高［4］，其水平會隨著缺血時間的延長而增高［5，6］。內毒素是革蘭氏陰性細菌細胞壁的一種成分，如果腸道革蘭氏陰性細菌過度生長，就會擴大內毒素池，此時若腸道屏障受損，就會使細菌和內毒素溢入血液循環(huán)，即所謂的“移位”現象，進一步對全身器官組織造成嚴重損害，甚至引起SIRS和MODS。本實驗證實，B組大鼠血清中D-乳酸和內毒素水平明顯高于A組(P＜0.05)，說明腸缺血再灌注后腸黏膜屏障嚴重損壞，通透性顯著增加，細菌發(fā)生了“移位”。D組中D-乳酸和內毒素水平低于B組和C組(P＜0.05)，說明蘆丁可能抑制了腸道菌群“移位”，阻止損傷的加重。

研究表明抑制中性粒細胞的激活可以保護小腸缺血再灌注損傷［7］。無論是缺血期還是再灌注期，組織中都存在大量中性粒細胞聚集，它被激活后會釋放大量氧自由基，尤其在再灌注期氧供充足時，氧自由基的產生呈爆發(fā)式。氧自由基加上各種炎癥介質和細胞因子，一方面直接造成腸組織細胞損傷，另外一方面參與介導SIRS和MODS的發(fā)生發(fā)展。中性粒細胞的嗜天青顆粒中有一種能清除氧自由基的酶-髓過氧化物酶(MPO)，每個中性粒細胞所含的MPO的量是一定的，所以MPO被公認為中性粒細胞的標志物［8］。本實驗發(fā)現，B組比A組腸組織中的MPO增多(P＜0.05)，表明缺血再灌注時有大量中性粒細胞向腸組織聚集并且活化，D組MPO明顯少于B組和C組(P＜0.05)，說明蘆丁可以抑制中性粒細胞的聚集，這可能與蘆丁的抗炎作用有關，武征等人通過大鼠急性胰腺炎模型證實，蘆丁通過抑制NF-κB的活化使靶基因TNF-α、ICAM-1等炎癥性細胞因子表達降低，從而抑制炎癥級聯反應［9］。

4 結論

蘆丁可降低腸缺血再灌注損傷中氧自由基的水平，恢復SOD活性，抑制脂質過氧化反應，保護腸道屏障功能，改善腸黏膜通透性，使細菌“移位”減少，抑制炎癥反應，起到對腸缺血再灌注損傷的保護作用。

［1］林靜.蘆丁的臨床藥理特點.中國臨床藥理學雜志，2009，25(3)：263.

［2］Hoffman JW Jr，Gilbert TB，Poston RS，et al.Myocardial reperfusion injury：etiology，mechanisms，and therapies.Extra Corpor Technol，2004，36(4)：391-411.

［3］顧洪雁，張媛英，翟靜，等.維生素C和蘆丁對力竭運動小鼠組織自由基代謝的影響.中國臨床康復，2005，44(9)：132-134.

［4］Novak F，Heyland DK，Avenell A，etal.Glutamine supplementation inserious illness：a systematic review of the evidence.Crit CareMed，2002，30(9)：2022-2029.

［5］MS，Uribarri J，et al.Metabolic utilization and renal handling of D-lactate in men.Metabolism，1985;34：621-625.

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［9］武征，趙維中，汪琳，等.蕓香苷對實驗性急性胰腺炎肺損傷的保護作用及機制.中國藥理學通報，2006，22(9)：1125.

473061 南陽醫(yī)學高等專科學校

2.2 血清中D-乳酸、內毒素含量見表2。

表2 D-lactate and Endotoxin levels in the serum(±s)

注：B組與A組比較，C組與A組比較，*P＜0.05;D組與B組比較，▲P＜0.05;D組與C組比較，△P＜0.05

組別 樣本例數n 血清D-乳酸(mmol/L) 血清內毒素(EU/ml)A 10 0.178±0.027 0.168±0.045 B 10 0.398±0.033*0.212±0.023*C 10 0.323±0.029*0.209±0.048*D 10 0.199±0.031▲△0.179±0.019▲△

2.3 血清及腸組織中MPO含量見表3。

表4 MPO levels in the serum and intestinal tissue(±s)

注：B組與A組比較，*P＜0.05;C組與B組比較，▽P＜0.05;D組與B組比較，▲P＜0.05;D組與C組比較，△P＜0.05

組別 樣本例數n 血清MPO(u/ml) 組織MPO(u/ml prot)A 10 48.16±7.14 0.39±0.12 B 10 128.39±30.452*1.54±0.19*C 10 84.67±7.97▽0.92±0.08▽D 10 59.67±9.81▲△0.54±0.10▲△