miR-214對人肺癌A549細胞增殖和侵襲能力的影響

林述琨 王耀鵬 溫吉海

1.大連，普蘭店市中心醫院病理科；2.普蘭店市中心醫院肺外科

肺癌是對人類生命威脅最大的惡性腫瘤之一。 早期研究表明在部分人類癌癥發病機制中MicroRNA(miRNA)的改變可能參與調控[1]。小分子RNA(miRNAs)是一種內源性的單鏈非編碼RNA，成熟miRNA主要通過與靶基因的3UTR區特異結合來抑制靶基因的轉錄和翻譯過程，引起靶基因mRNA發生降解或翻譯受到抑制，進而發揮其生物學功能[2]。miRNA被認為在多種細胞過程中發揮關鍵作用如擴散、生長、分化與細胞凋亡[3,4]。近年來越來越多的研究發現miRNA在乳腺癌、 胃癌、直腸癌及白血病等許多惡性腫瘤的發生過程起著癌基因及抑癌基因作用。但對于miRNA在肺癌發病機制中的作用還知之甚少[5]。本研究構建了miR-214的真核表達載體，并將其轉染人肺癌A549細胞，以探討其對A549細胞增殖和侵襲能力的影響。

1 材料和方法

1.1 細胞培養和轉染人肺腺癌細胞株A549，用含有10%新生牛血清，100 U/ml的青霉素和100 U/ml的鏈霉素的DMEM培養液在37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養。當細胞生長至對數生長期后，按照lipo2000(Invitrogen公司)說明書的方法進行轉染。細胞轉染48h后進行后續相關實驗。

1.2 Real-time PCR用Trizol(Invitrogen公司)提取細胞總RNA后反轉錄為cDNA(Takara)。miR-214的反轉錄引物為5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA CTG CC-3′；real-time PCR引物序列：上游引物5′- GGA CAG CAG GCA CAG ACA-3′，下游引物5′- CAG TGC AGG GTC CGA GGT-3′。以U6為內參，反轉錄引物序列為5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA AAA TAT GGA AC-3′；real-time PCR引物序列：上游引物5′-TGC GGG TGC TCC GCT TCG GCA GC-3′，下游引物5′-CAG TGC AGG GTC CGA GGT-3′。使用SYBR Green(Takara)染料法進行反應，95 ℃預變性10min，95℃變性5s，60℃退火34s，74℃熒光檢測3s，共40個循環。以2–ΔΔCt值比較兩者之間的差異。每組重復設置3個復孔。

1.3 miR-214表達質粒構建根據miR-214前體在GenBank中的序列，設計PCR引物，引物序列為：Forward：5'-CTG TTA CGC AAA TTA TCC ATG TT-3'，Reverse：5'-AAT GGG TTT TAT TAT ATT TCA TA -3'(引入HindⅢ和XhoⅠ 酶切位點)，目的片段亞克隆到pCDNA3.1(+)上，經測序和Real-time PCR驗證。

1.4 MTT法取對數生長期的A549細胞，0.25%胰酶消化細胞，用含有10%新生牛血清的RPMI 1640完全培養液終止消化，調整細胞密度為2×105個/ml，制備單細胞懸液。各取500μl接種于24孔板中，待細胞融合度達80%時，進行轉染，每組設3個平行復孔。細胞轉染24h后，用1ml培養液懸浮細胞，稀釋5倍后接種于96孔板(每組設6個重復)，分別于接種后24、48、72h和96h，每孔加入20μl MTT(5mg/ml)，繼續培養4h后，棄上清液，加入DMSO100μl/孔，振蕩處理溶解結晶紫，在酶聯免疫檢測儀570nm處測吸光度(OD)值。

1.5 Transwell小室將A549細胞培養于12孔板，在細胞融合度達80%時進行轉染。細胞轉染6h后更換為完全培養液， 繼續培養18h，然后用0.25%的胰酶消化細胞，加入2ml完全培養液終止消化，離心后用Opti-MEM調整細胞密度為3×105個/ml的單細胞懸液。取100μl單細胞懸液移至上室內，下室中加入600μl含10%新生牛血清的 RPMI 1640培養液，置于37℃、CO2體積分數為5%培養箱內培養48h，每組設3個平行復孔。取出小室，移走上室內的培養液，用滅菌的棉棒將上室內的細胞輕輕刮掉，置于0.1%結晶紫染色液中染色30min，取出小室，在蒸餾水中將其漂洗3次。倒置顯微鏡下觀察通過小室基膜的細胞并計數。

1.6 統計學方法應用SPSS13.0統計學軟件進行統計學分析。采用t檢驗進行兩樣本間比較，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 成功構建miR-214 真核表達質粒重 組 質 粒pcDNA 3.1(+)-miR-214經HindⅢ和XhoⅠ雙酶切后，電泳結果顯示得到2個片段，分別為534bp的miR-214和5405bp的線性pcDNA3.1(+)載體 ，結果與理論值相符合(見圖1)。

圖1 瓊脂糖電泳鑒定重組pcDNA3.1(+)-miR-214真核表達載體

圖2 Real-time PCR法鑒定miR-214表達

2.2 pcDNA3.1(+)-miR-214轉染A549細胞后miR-214過表達Real-time PCR檢測結果顯示pcDNA3.1(+)-miR-214轉 染 組，與 pcDNA3.1(+)空載體轉染組和空白對照組相比，pcDNA3.1(+)-miR-214 轉染組 中miR-214的mRNA的表達量明顯增加 (P<0.01)，見圖2。表明構建獲得的重組表達載體pcDNA3.1(+)-miR-214能夠在人A549細胞中高水平地表達miR-214。

2.3 miR-214對A549細胞增殖能力的影響MTT法檢測結果提示，在24h、48h、72h和96h時，轉染pcDNA3.1(+)-miR-214重組質粒組細胞的增殖速度明顯的低于pcDNA3.1(+)空載體組和空白對照組(blank control)，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

2.4 MiR-214對A549細胞侵襲能力的影響通過transwell小室比較A549細胞在轉染pcDNA3.1(+)-miR-214后細胞侵襲能力的改變，結果顯示，轉染重組質粒pcDNA3.1(+)-miR-214組穿膜細胞數為(57.67±7.02)個/視野，而pcDNA3.1(+) 空載體組和空白對照組穿膜細胞數分別為(182±15.4)個/視野和(178±24.97)個/視野(見圖4)，轉染重組質粒pcDNA3.1(+)-miR-214組 與 pcDNA3.1(+)空載體組和空白對照組相比，穿膜細胞數明顯減少，差異具有統計學意義(P<0.05)。以上結果表明，miR-214能夠抑制A549細胞的侵襲能力。

圖3 MTT法檢測細胞增殖能力

圖4 Transwell小室檢測A549細胞侵襲能力(×200)，*P<0.05

3. 討論

肺癌是我國發病率和死亡率增長最快的惡性腫瘤，轉移和復發是患者死亡的主要原因。近年的研究表明，microRNA與多種腫瘤的發生、發展和遠處轉移密切相關；在多種腫瘤的發生過程中起到癌基因和抑癌的作用。研究報道miR-214肝癌、宮頸癌和乳腺癌中低表達，miR-214可以抑制乳腺癌的侵襲和轉移[6-9]。然而，迄今為止miR-214在肺癌中的作用未見報道。

本研究首先構建了pcDNA3.1(+)-miR-214重組質粒，該方法能夠較好地模擬體內miRNAs成熟的過程；該載體在多克隆位點上游有CMV啟動子，依賴于polymeraseⅡ，有較強的活性，是真核過表達最常用的啟動子，具有較強的轉錄活性，能夠使插入的目的基因穩定表達；Amp＋和neo＋抗性基因便于進行構建和G418篩選，建立穩定表達的細胞系[14]。與病毒載體[15]相比，其操作過程相對簡便，一般的實驗條件即可完成。

為了檢測重組質粒轉染A549細胞后是否能夠高表達miR-214，本研究首先通過real-time PCR檢測A549細胞轉染重組質粒pcDNA3.1(+)-miR-214、空載體pcDNA3.1(+)和空白對照組中miR-214表達。結果顯示轉染pcDNA3.1(+)-miR-214后A549細胞內miR-214過表達。

我們進一步研究了miR-214在肺癌A549細胞中的功能。研究發現miR-214可明顯影響A549細胞的增殖能力，這種增殖能力的改變是否引起細胞周期的改變，是否對腫瘤細胞的進程起到抑制作用，將有待進一步深入研究。本研究還發現，miR-214過表達能夠明顯抑制A549細胞的侵襲能力，這可能是由于miR-214的過表達引起細胞內腫瘤轉移相關基因表達水平改變所致。目前研究認為，以上這些生物學功能的改變多是miR-214引起其靶基因的改變所致；本課題組將在下一步的研究中進一步探討。總之，本研究結果表明，miR-214具有抑制A549細胞的增殖和侵襲能力改變，是肺癌生物治療中的一個可能的候選靶點。

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