腦梗死肝陽化風證與陰虛風動證蛋白質組學比較研究

王 立，梁清華，陳曉玲，陽 歷，唐 科，劉建軍，貝玉章

（1.瀏陽市集里醫院神經內科，湖南 瀏陽430100；2.中南大學湘雅醫學院中西結合研究所，湖南 長沙410008）

蛋白質組學研究基因的最終表達產物是具有活性的蛋白質，以蛋白質雙向電泳和新型質譜分析為技術平臺，同條件和狀態下蛋白質組的性質和變化規律，是后基因組時代的研究重點。目前腦梗死的發生機制雖然復雜，但歸納起來不外虛（陰虛、氣虛）、火、風、痰、瘀幾個方面。有人從腦梗死患者四診信息和檢測指標的搜集，運用聚類分析、對應分析、因子分析和結構方程等統計方法，初步將本病分為風瘀證、陰虛證、氣虛證、火熱證、痰濕證，然而腦梗死證的本質研究還沒有確切結論。為進一步探討腦梗死各種證型之間關聯因素，本實驗采用雙向凝膠電泳分離腦梗死肝陽化風證與陰虛風動證血清，用PD-QUES 分析2D電泳圖譜，基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS) 分析獲取肽質量指紋圖譜（PMF），Mascot 軟件檢索SwissProt 數據庫鑒定蛋白質點，從蛋白質組學角度比較腦梗死肝陽化風證與陰虛風動證，從更深層次闡明腦梗死肝陽化風證與陰虛風動證，研究其蛋白質組成成分、表達水平與修飾狀態，闡明腦梗死肝陽化風證與陰虛風動證的病理生理機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

實驗組：腦梗死肝陽化風證與陰虛風動證患者為2010年2月至2011年10月瀏陽市集里醫院門診及住院病人。其診斷標準參照第六版《神經內科學》腦梗死診斷標準[1]。肝陽化風證與陰虛風動證辨證標準參照中南大學湘雅醫學院中西結合研究所制定的標準[2]：肝陽化風證 眩暈欲倒，肢麻，手足震顫，語言謇澀，半身不遂。陰虛風動證 手足蠕動或筋肉掣動，午后潮熱，盜汗，口干咽燥，形體消瘦。共收集病例32 例，其中男性17 例，女性15 例；年齡41～68 歲，平均年齡（52.7±8.1）歲。對照組：10 例均為健康者，其中男性6 例，女性4 例；年齡40～64 歲，平均年齡（52.7±6.9）歲。全部病例均排除心、肝、腎等功能不全者，有活動性胃腸病變者，血液及內分泌系統疾病者，過敏體質者，孕期或哺乳期婦女。

1.2 方法

1.2.1 試劑 二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺、雙向凝膠電泳標準蛋白質、甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲-酮-胰蛋白酶、碳酸氫銨、三氟乙酸、乙睛和基質а-氰基-4-羥基肉桂酸均為Sigma 公司產品，固相pH 梯度干膠條，IPG 緩沖液、兩性電解質、覆蓋液、低分子量標準蛋白質和尿素、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、甘 氨 酸、Tris、CHAPS、SDS 均 為 Amersham Biosciences 產品，甲醛和EDTA 二鈉，考馬斯亮藍G250為國產分析純。

1.2.2 儀器 IPGphor 等電聚焦儀、Ettan DALT 垂直電泳槽、PD-QUEST 凝膠圖像分析軟件、Imagescanner掃描儀、Labscan 掃描控制和分析前處理軟件。

1.2.3 標本采集及處理 取腦梗死肝陽化風證與陰虛風動證患者及正常人外周靜脈血3～4 mL 于非抗凝的滅菌離心管中，室溫下靜置1 h，離心10 min（3 000 r/min）后，吸取上清液。

1.2.4 血清蛋白的提取 按Sigma 公司ProteoPrep Blue Albumin Depletion Kit 去除白蛋白與IgG，BCA 蛋白定量試劑盒測蛋白質濃度，其余上清分裝置-70 ℃備用。

1.2.5 雙向凝膠電泳 （1） 第一向等電聚焦（IEF）：IPG-DALT 主要參照IPGphor 等電聚焦系統使用指南進行血清蛋白與水化液。30 V 水化14 h 后依次經100 V 1 h、500 V 1 h、1 000 V 1 h、8 000 V 8.5 h 進行等電聚焦，水化和聚焦均在20 ℃進行，總電壓時間積為68 000 Vh；（2）平衡：等電聚焦后，迅速取出IPG 膠條分別于10 mL 平衡A 液和10 mL 平衡B 液中各平衡15 min；（3） 第二向垂直SDS-PAGE 電泳：將平衡后的IPG 膠條轉移至12%的0.75 mm 厚的凝膠上端，使IPG 膠條與凝膠上端緊密貼合，在一端加入低分子量的蛋白質標準品，排盡氣泡后，用含痕量溴酚蘭的0.8%的瓊脂糖封頂。電泳條件為：2.5 W/膠電泳30 min 后以15 W/膠恒功率電泳，直至溴酚藍指示線到達凝膠底邊處停止電泳。

1.2.6 考馬斯亮藍染液染色 考馬斯亮藍染液置搖床上染色12 h。染色后的膠條用20%乙醇脫色20～30 min，然后用DDW 水洗2～3 次，每次5～10 min，直至背景清晰為止。

1.2.7 圖像分析 Imagescanner 掃描儀掃描考染的凝膠，PD-QUES 圖像分析軟件依次進行點檢測、背景消減，建立平均凝膠，匹配、量化獲取斑點的相關信息等分析。斑點位置的重復性按Gorbett 的方法[4]進行計算。所有數據的統計分析在SPSS for Windows 11.0 軟件和Excel 上進行.

1.2.8 質譜分析 隨機選取并切割分辨較好的蛋白質點于1.5 mL Eppendorf 管中，按本實驗室以往方法［3]稍作修改，50%乙腈和50 mmol 碳酸氫氨脫色30 min，水洗數遍直至藍色消失，乙氰脫水冷凍抽干，5 μL TPCK-Trypsin 冰上吸脹60 min 后37 ℃酶解13 h，覆蓋30 μL 萃取液萃取60 min，重復萃取過程2 次，將2 次萃取液收集于0.5 mL Eppendorf 管中，冷凍抽干儀濃縮樣品至總體積5 μL 左右。取0.5 μL 樣品與等體積飽和基質液CCA 混合，點樣于不銹鋼板上，空氣中干燥。制備好的樣品在Voyager-DE STR MALDI-TOF-MS 儀上分析，采用反射模式，正離子譜測定，離子源加速電壓為20 000 V，反 射 電 壓 比 為1.12，N2 激 光 波 長337 nm，脈沖寬度為3 ns，離子延遲提取100 ns，真空度4×10-7Torr，質譜信號單次掃描累加50 次，質譜使用ATCH 作為外部標準校正，獲得肽質量指紋圖。

1.2.9 數據庫查詢 采用Matrix Science 的Mascot軟件搜索SWISS-PROT 數據庫，搜索條件為：肽片斷質量最大誤差控制在0.5 Da，酶解片斷不完全選擇為1 個，物種來源為人類，離子選擇 [M+H]+和monoisotopic，固定修飾為半胱氨酸碘乙酰胺化，可變修飾為蛋氨酸氧化，Mascot 配套軟件 Mascot Distiller 過濾肽質量峰。

2 結果

2.1 腦梗死肝陽化風證與陰虛風動證血清差異蛋白質點比較

應用PDQuest 2DE 軟件分析雙向電泳圖，共檢測到29 個蛋白質點，雙向電泳圖重復性好。腦梗死肝陽化風證組與陰虛風動證組血清差異蛋白質點見表1，兩組間差異有統計學意義（χ2=9.85，P＜0.05）。腦梗死肝陽化風證與陰虛風動證其典型的雙向電泳圖見圖1，腦梗死肝陽化風證與陰虛風動證血清雙向凝膠電泳第1、2 蛋白質點差異點見圖2。

表1 腦梗死肝陽化風證與陰虛風動證血清差異蛋白質點

圖1 腦梗死肝陽化風證與陰虛風動證典型的雙向電泳圖(考染)

圖2 腦梗死肝陽化風證與陰虛風動證血清雙向凝膠電泳第1、2 蛋白質點差異點電泳圖

2.2 腦梗死肝陽化風證與陰虛風動證MALDITOF-MS 肽質量指紋圖分析

從腦梗死肝陽化風證與陰虛風動證正常人匹配的點中選擇29 個分辨清楚的蛋白質點，做好標記，進行MALDI-TOF-MS 分析，并以ACTH 為外標進行校正，共獲得了87 張肽質量指紋圖。1 號蛋白質點的肽質量指紋圖見圖3。

圖3 腦梗死肝陽上亢蛋白質1 號蛋白質點的肽質量指紋圖

2.3 數據庫查詢結果

用Matrix Science 的Mascot 軟件搜索SWISSPROT 數據庫圖，結果示腦梗死肝陽化風證N 甲基-天冬氨酸蛋白受體、c 反應蛋白、單核細胞趨化蛋白-1、轉鐵蛋白、血清銅藍蛋白、S100β 蛋白(S100β)、細胞骨架蛋白等表達上調。腦梗死陰虛風動證糖蛋白、基質金屬蛋白酶-9、神經元特異性烯醇化酶、蛋白S、信號傳導蛋白等表達上調。腦梗死肝陽化風證與陰虛風動證主要差異蛋白質點見表2。

表2 腦梗死肝陽化風證與陰虛風動證主要差異蛋白質點

3 討論

既往研究認為急性腦梗死患者的發病機制之一是動脈內膜功能紊亂，導致動脈硬化因子增高，激活補體系統，造成血管內膜受損。C 反應蛋白與單核細胞結合誘導組織因子表達，使促凝血過程發生，有報道CRP 水平升高者發生ACI 的幾率是正常者的2倍［4］。CRP 同時在腦梗死病理過程中扮演重要角色，腦卒中后2 h 細胞啟動炎性介質反應，從而引起CRP 水平表達增高，使病理血管損傷反應增大，加重腦梗死的發展。腦梗死基本病因為動脈粥樣硬化，動脈粥樣硬化往往導致頸內動脈與椎-基底動脈系統的狹窄和血栓形成，動脈粥樣硬化斑塊形成更是腦梗死的殺手锏。血管細胞黏附分子是早期巨噬細胞黏附趨化反應的主要參與因素之一，抗炎因素和致炎因素的失平衡狀態最終導致了動脈粥樣硬化斑塊的不穩定。基質金屬蛋白酶-9 是一組鋅、鈣離子依賴性蛋白水解酶家族，是細胞外基質（extracellular matrix，ECM）降解和重構的重要介質，存在于正常人體，參與多種生理和病理過程，有助于創傷愈合和血管生成[5]。腦梗死缺血血管痙攣往往與血管內皮生長因子緊密關聯。

證候是在致病因素作用下，機體內外環境各系統之間相互關系發生紊亂所產生的綜合反應，是反映疾病處于某一階段病因、病性、病位、病勢等病理要素的綜合性診斷概念。腦梗死肝陽化風證與陰虛風動證血清差異蛋白質點差異有統計學意義。然而腦梗死肝陽化風證與陰虛風動證為何蛋白質差異點有如此明顯區別，可能與如下原因相關：腦梗死肝陽化風證為肝陽亢逆無制而表現動風的證候，可能與細胞炎癥介質反應緊密關聯，其中與炎性介質反應引起CRP 高水平表達、血管細胞黏附分子參與啟動的動脈粥樣硬化斑塊有關聯。陰虛風動證是陰液虧虛，筋脈失于濡養引動肝風的證候，腦梗死陰虛風動證與動脈粥樣硬化和炎性介質反應關聯因素不大，病因很難確認，與基質金屬蛋白酶、血管內皮生長因子等引起的血管痙攣緊密關聯。本實驗證明了腦梗死肝陽化風證與陰虛風動證其蛋白質組成成分、表達水平與修飾狀態有顯著差異，蛋白質組學能對各自證型有典型代表意義。

盡管通過質譜分析和數據庫查詢，我們所獲得的還只是部分蛋白質粗略的功能信息，但是，本實驗為一步構建腦梗死肝陽化風證與陰虛風動證血清蛋白質表達譜和蛋白質組學數據庫提供了有意義的資料，為二者臨床與病理進行了深入分析，為尋找可以用于腦梗死肝陽化風證與陰虛風動證診斷與治療的相關蛋白質提供了線索。本實驗結果仍有待進一部驗證。

[1]賈建平.神經內科學（第6 版）[M].北京：人民衛生出版社，2012：175.

[2]金益強.中醫肝臟象現代研究與臨床[M].北京：人民衛生出版社，2000：237-238.

[3]Corbett J M，Dunn M J，Posch A，et al.Positional reproducibility of protein spots in two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis using immobilised pH gradient isoelectric focusing in the first dimension: an interlaboratory comparison [J].Electrophoresis，1994，15(8-9)：1 205-1 211.

[4]Ma P C，Blaszkowsky L，Bharti A，et al.Circulating tumor cells and serum tumor biomarkers in small cell lung cancer[J].Anticancer Res，2003，23(1A)：49-62.

[5]苗 青，王 菲，周 媛，等.急性腦梗死患者血糖、纖維蛋白原水平與預后關系研究[J].中華全科醫學，2009，7（7）：246-247.