骨髓瘤細胞裂解物致敏的DC-CIK細胞抗骨髓瘤細胞作用①

羅 云 白鳳霞 張 萍 婁世鋒 (重慶醫科大學附屬第二醫院血液科，重慶400010)

多發性骨髓瘤(Multiple Myeloma，MM)是漿細胞的惡性腫瘤，好發于老年人，占血液腫瘤的第二位。隨著多發性骨髓瘤治療新藥的出現及干細胞移植技術的進步，多發性骨髓瘤治療緩解率較前大為提高，生存時間明顯延長[1];但復發、難治仍是臨床面臨的巨大難題。尋找新的治療手段或聯合治療方案仍然具有緊迫性，過繼細胞免疫治療毒副反應輕，適應人群廣，通過直接向腫瘤患者輸注具有抗腫瘤活性的免疫活性細胞，使其在體內發揮抗腫瘤作用。CIK細胞單獨或與DC細胞聯合已廣泛用于實體腫瘤和白血病，但鮮見用于骨髓瘤。我們自2011年7月～2011年12月體外培養負載骨髓瘤裂解物的健康供者DC聯合CIK細胞，觀察其對骨髓瘤U266細胞株的殺傷作用，以期進一步應用于臨床。

1 材料與方法

1.1 材料 U266細胞株購自中國醫學科學院腫瘤醫院細胞庫，RPMI1640培養基購自 Gibco公司，IFN-γ購自上海凱茂生物公司，IL-2購自北京雙鷺藥業、IL-4、rhGM-CSF廈門特寶生物公司饋贈，淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品公司，TNF-α購自Protech公司，蛋白定量試劑盒購自南京凱基生物公司，NP40購自Abbott公司;熒光素FITC標記的鼠抗人CD3、CD1a及CD83，藻紅蛋白PE標記的鼠抗人CD8和CD56及CD86和CD80單克隆抗體購自BD公司;CO2培養箱(上海力申科學儀器公司)，倒置顯微鏡(重慶光學儀器廠)，全自動生化儀(日本日立公司)，離心機(湖南平凡儀器廠)，流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 骨髓瘤U266細胞抗原制備 U266細胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培養液中培養，每3～4日換液;取足夠的對數生長期細胞，在-80℃深低溫冰箱冰凍，然后復溫至37℃，反復凍融3次，再于冰浴中超聲波破碎后，離心(1 000 r/min，5分鐘)，收集上清液，用孔徑為0.22 μm濾膜過濾滅菌，通過蛋白定量試劑盒檢測蛋白含量，最后-80℃保存，作為抗原備用。

1.3 CIK細胞的培養征得異基因干細胞移植供者知情同意并簽署知情同意書后，用血細胞分離機(COBE公司)單個核程序單采健康供者(共5例，具體見表1)。

單個核細胞懸液100 ml，自體血漿200 ml，然后淋巴細胞分離液再次分離收集細胞，分裝，部分細胞凍存，剩余細胞培養在含10%自體血漿RPMI1640培養液中，4～6小時后，貼壁細胞用于DC細胞培養，取懸浮細胞離心，重懸細胞，調整細胞密度為1 ×106ml-1，加入含 IFN-γ(1 000 U/ml)培養1 日，第2日加入含小鼠抗人CD3單克隆抗體(100 mg/ml)、IL-2(1 000 U/ml)的CIK培養液，置于37℃，5%CO2體積分數為的培養箱中，每隔3天補充新鮮培養液。

1.4 DC細胞的培養 取上述貼壁細胞培養在含10%自體血漿RPMI1640培養液中，培養液中加入rhGM-CSF(1 000 U/ml)和 IL-4(1 000 U/ml);每3天換液，第7日將培養DC細胞分為2組，一組加入TNFα 500 U/ml，另一組加入U266細胞裂解物100 μg/ml，分別與上述培養 CIK細胞再共培養7日(n=5)。

表1 異基因干細胞供者資料Tab．1 Donor characteristics

1.5 CIK及DC細胞形態觀察 在倒置顯微鏡下觀察培養細胞的形態，收集培養細胞PBS洗滌后涂片，3%戊二醛4℃固定2小時，再以體積分數為1%鋨酸固定，梯度酒精脫水，用六甲基二硅胺烷干燥，噴鍍、導電，KYKY 1000B型掃描電鏡觀察，并攝片。

1.6 CIK及DC細胞表型測定 收集培養的細胞1×106ml-1，離心用PBS洗滌2次，每管分別加入藻紅蛋白PE標記，熒光素FITC標記CD單抗各10 μl，室溫避光孵育30分鐘，再用PBS洗掉未結合單抗，流式細胞儀上機檢測細胞表面標志(n=5)。

1.7 CIK細胞及DC-CIK細胞殺傷活性檢測(LDH法) 24孔板中將培養的CIK與DC-CIK細胞與靶細胞 U266 按5∶1、10∶1 及20∶1 混合，同時設定自然釋放孔及單獨加NP40的最大釋放孔，每組設3個復孔;37℃ 5%CO2培養箱孵育4小時后離心取上清液，全自動生化儀測定LDH含量，同時以白血病K562細胞株作為對照組(n=5)。按如下公式計算殺傷率:殺傷率(%)=(試驗孔-靶細胞自然釋放孔)/(靶細胞最大釋放孔-靶細胞自然釋放孔)×100%。

2 結果

2.1 CIK及DC細胞形態 培養的CIK細胞大部分為圓形，少數為梭形(圖1)，DC細胞培養3～4天后開始出現突起，有聚集成簇現象(圖2)，貼壁5～6日后逐漸開始懸浮生長，掃描電鏡下可見:DC體積較大，胞體突起形成不規則形態，表面粗糙，有圓形或橢圓形隆起，層疊狀皺襞(圖2)。

圖1 倒置顯微鏡下培養12日的CIK細胞(×200)Fig．1 CIK cells were observed by inverted microscope at 12 days(×200)

圖2 倒置顯微鏡(A，×400)及掃描電鏡(B，×1 500)下觀察培養7日的DC細胞圖片Fig．2 Dendritic cells were observed by inverted microscope(A，×400)and scanning(B，×1 500)

圖3 培養第7日及培養第14日的CIK細胞CD3、CD56共表達Fig．3 CIK cells surface co-expressed CD3 and CD56 at 7 days and 14 days

2.2 CIK及DC細胞表面標志 利用流式細胞儀檢測培養12～14日CIK細胞高表達CD3，CD3及CD56共表達明顯升高(圖3)，未成熟DC細胞高表達CD1a，經過 TNF-α或瘤細胞裂解物刺激表達CD86、CD80明顯升高。

2.3 CIK和負載瘤細胞裂解物DC-CIK對U266殺傷作用 U266細胞自然釋放及培養CIK細胞和DC-CIK作用U266細胞后乳酸脫氫酶經過全自動生化儀檢測，兩組各自的殺傷活性均隨效靶比升高而增強，各效靶比間的差異有顯著統計學意義(P＜0.05)。負載瘤細胞裂解物DC-CIK與單獨CIK在同效靶比下殺傷性更強，各組間差異有顯著統計學意義(P＜0.05)。培養的CIK細胞對K562細胞殺傷率亦隨效靶比升高而增加，但負載骨髓瘤細胞抗原DC細胞與CIK細胞共培養后對K562細胞殺傷率與單獨CIK細胞比較無明顯差異(P＞0.05)，見圖4、5。

圖4 CIK及DC+CIK對U266細胞作用(n=5)Fig．4 CIK cells or DC+CIK cytotoxic effect for myeloma U266 cell(n=5)

圖5 CIK及負載骨髓瘤抗原的DC+CIK對K562細胞作用(n=5)Fig．5 CIK cells or DC+CIK cells cytotoxic effect for K562 cell(n=5)

3 討論

多發性骨髓瘤是高發于老年人的血液系統常見惡性腫瘤，發展較為緩慢。臨床治療效果欠佳，完全緩解率(CR)低，自體移植可提高CR率，但多數患者因體內殘留的瘤細胞而使疾病復發。異基因干細胞移植因患者年齡問題多采用非清髓移植方式，本研究通過異基因CIK細胞及負載瘤細胞抗原的DCCIK細胞證實了兩種培養細胞均對骨髓瘤細胞U266有殺傷活性，為骨髓瘤自體或非清髓異基因干細胞移植術后應用CIK或DC-CIK細胞清除體內殘留的瘤細胞以減少疾病復發提供理論和實驗依據。LDH釋放法檢測結果顯示:負載瘤細胞抗原的DCCIK細胞對U226細胞的殺傷活性在相同效靶比時比單獨CIK細胞更強，差異有顯著統計學意義。

CIK細胞為一異質細胞群，大于90%表達CD3，這其中包括約35%共表達CD 56的細胞[2]。CIK細胞輸注首先要保證質量及數量，應減少或避免傳染疾病的機會，常規的來源以自體外周血居多，經過體外培養后CD3+CD56+細胞能夠大量擴增，而在未培養的外周血中含量極少，只有1% ～5%。在培養2～3周后，CIK細胞比例可由0.1% ～0.13%上升至19%～20.5%，細胞數量平均增加25倍(2.2～525倍)。我們培養的CIK細胞表型與文獻相似，與以往的LAK、CD3AK細胞相比，CIK細胞擴增能力及殺傷活性均有提高。CIK細胞既有T淋巴細胞的抗腫瘤特性，又有NK細胞的非MHC限制性殺瘤特點，對很多腫瘤均有殺傷活性，很多研究也已證實了該活性，如對結腸癌SW620和LOVO細胞株;鼻咽癌 CNE-1、CNE-2Z、NP69 細胞株;腎癌 A704;宮頸癌、卵巢癌等，且對自體和異體腫瘤等均有較好的抗瘤效果。CIK細胞作用機理在于可分泌穿孔素(Perforin)及顆粒酶(Granzyme)殺傷靶細胞;同時CIK細胞活化后可分泌多種細胞因子，如IL-2，TNF-α，IFN-γ等，不僅可直接殺傷腫瘤細胞，還可通過對機體免疫系統的調節來間接殺傷腫瘤細胞[3]。Introna等[4]做了異基因(供者)CIK治療異基因造血干細胞移植后復發病例的Ⅰ期臨床研究:移植后復發的11例患者入組，治療后1例病情穩定，1例血液學情況改善，3例完全緩解，結果令人鼓舞。

DC是已知功能最強的抗原呈遞細胞(APC)，存在于除腦組織外的所有組織器官中，與B細胞、巨噬細胞、活化的T淋巴細胞等其它APC不同的是，DC是唯一能刺激初始T淋巴細胞增殖的APC，是機體免疫反應的始動者。DC通過MHCⅡ類分子途徑激活初始CD4+T細胞，DC也能直接向CD8+CTL呈遞抗原，CD4+和CD8+T 細胞通過共同分泌細胞因子或直接殺傷腫瘤細胞而產生抗腫瘤反應[5]。DC在體內的數量極少，占人外周血單個核細胞的1%以下，體外分離腫瘤抗原脈沖DC，使其致敏得到DC瘤苗，該瘤苗進入體內不僅保證腫瘤抗原被有效攝取、呈遞，還可提供攻擊腫瘤細胞必需的共刺激分子，能夠結合并殺傷腫瘤細胞[6]。負載腫瘤抗原DC細胞與CIK細胞共培養取得更強殺傷活性，估計與CIK細胞不均質，部分CD8細胞被激活有關。

1 Bladé J，Rosi?ol L，Cibeira M T et al．Hematopoietic stem cell transplantation for multiple myeloma beyond 2010[J].Blood，2010;115(18):3655-3663.

2 Linn Y C，Lau L C，Hui K M et al．Generation of cytokine-induced keller cells from leukaemic samples with in vitro cytotoxicity against autologous and allogeneic leukaemic blasts[J].Br J Haemat，2002;116(1):78-86.

3 楊 葳，徐銘寶.CIK細胞治療惡性腫瘤研究進展[J].國用醫藥，2009;29(4):217-219.

4 Introna M，Borleri G，Conti E et al．Repeated infusions of donor-derived cytokine-induced killer cells in patients relapsing after allogeneic stem cell transplantation:a phase I study[J].Haematologica，2007;92(7):952-959.

5 Fields R C，Shimizu K，Mule J J.Murine dentritic cells pulsed with whole tumor lysates mediates potent antitumor immune responses in vitro and in vivo[J].Proc Natl Acad Sci USA，1998;95:9482-9487.

6 Raje N，Hideshima T，Davies F E et al．Tumour cell/dendritic cell fusions as a vaccination strategy for multiple myeloma[J].Br J Haemat，2004;125:343-352.